[发明专利]华法林个体化用药基因检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能用于快捷检测华法林个体化用药相关基因常见多态性位点的试剂盒。

背景技术

华法林是临床上最常用的抗凝药物，在美国华法林每年的处方量在所有药物中排名第一。华法林主要用于血栓栓塞性疾病的治疗，如房颤、静脉血栓等。但是由于其治疗窗窄，个体差异大(不同患者所需剂量相差最高可达二十倍以上)，易导致过度抗凝或抗凝不足的不良事件发生。

现在研究表明遗传因素是导致华法林个体差异的主要原因。华法林是由S-华法林对映体和R-华法林对映体组成的消旋体，主要在肝脏中由肝微粒体酶代谢。更具生物活性的S-华法林由CYP2C9(细胞色素P4502C9)代谢。VKORCl(维生素K环氧化物还原酶复合物亚基1)是华法林作用的靶点，其能够将维生素K环氧化物还原成维生素K的氢醌式，进而参与凝血因子II、VII、IX、X的活化。多项研究表明，华法林相关基因的单核甘酸多态性(SNPs)与个体所需华法林剂量有关，并与华法林使用过程中抗凝不足或者出血等副作用的发生相关。华法林药物基因主要可以分为两类，首先是与华法林作用代谢和作用靶点相关的基因，如CYP2C9、VKORC1等；其次是与体内维生素K1代谢循环相关的基因，如CYP4F2、GGCX、EPHX1等。这些基因不同程度的影响华法林个体差异。在服用非华法林初始阶段，CYP2C9(rs1799853和rs1057910)多态性可引起2～3倍出血概率的发生。VKORC1基因多态性(rs9923231)对华法林的个体差异起着最重要的影响。CYP4F2基因多态性(rs2108622)突变纯合子患者所需剂量为野生型患者的2倍。GGCX基因多态性(rs699664)可解释2.3％个体间华法林差异。EPHX1基因多态性(rs1051740)可解释3.7％个体间华法林差异。美国FDA(食品药品管理局)于2007年、2010年两次修改说明书，要求华法林使用时要根据遗传信息个体化给药。仅根据CYP2C9和VKORC1的基因型就可以初步推算华法林的使用剂量(表1)。进一步根据多基因型及患者的基本信息建立的华法林给药剂量预测公式能更加准确的预测华法林的使用剂量。

表1根据VKORC1和CYP2C9基因型推荐的华法林每天的给药剂量(mg/d)

随着华法林起始剂量预测公式在临床的推广应用，对其用药相关基因(CYP2C9、VKORC1、CYP4F2、GGCX以及EPHX1)的多态性检测越来越受到临床医生的关注。开发稳定、经济、快捷、方便的华法林用药相关基因检测技术及试剂盒服务于临床和患者，显得越来越重要。现有的华法林用药相关基因检测技术有直接测序法(该方法过程比较繁琐、耗时长，费用昂贵)，荧光定量PCR(荧光探针成本较高)，高效液相色谱法(DHPLC)(结果判读容易出错，且当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量等)，高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)(只能分析纯度单一的小片段DNA，且要求有足够的PCR模板，对仪器要求高)，突变体富集PCR(需要两次PCR，而且需要酶切、操作复杂、耗时长、且容易污染)，合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)(该方法操作步骤比较繁琐，受实验条件影响较大，容易出现假阴性)，聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)(需要酶切、耗时长)，芯片分析(灵活性差，仪器设备较贵，成本较高)等。

发明内容

本发明旨在提供一种快捷、准确、高效、经济、实用，利于临床推广应用的检测CYP2C9(rs1799853和rs1057910)、VKORC1(rs9923231)、CYP4F2(rs2108622)、GGCX(rs699664)、EPHX1(rs1051740)基因多态性的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供的而技术方案为：

所述华法林个体化用药基因检测试剂盒中包括如下等位基因特异PCR引物：

基因CYP2C9rs1799853(序列如SEQ ID NO.19所示)扩增引物：

野生型引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAC-3′(SEQ ID NO.1)；

突变性引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAT-3′(SEQ ID NO.2)；

公共引物：5′-ACATGTTCTGGAATAGGTAATG-3′(SEQ ID NO.3)；