[发明专利]家蚕微孢子虫Met‑AP2基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其应用。

背景技术

家蚕微孢子虫病的病原家蚕微孢子虫是一类细胞内专性寄生的真核生物，之前一直属于原虫，近些年被划分到真菌类。因其具有垂直传播的特点使之成为了家蚕病原微生物中最受人关注的一种，也是家蚕病原微生物中唯一法定检疫的疫病。从19世纪发现到现在，家蚕微孢子虫病对各国的养蚕业造成了巨大的损失。除此之外，其他不同的微孢子虫也可侵害其它昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。不论是在哪种微孢子虫病的治疗上都未取得很好的结果，而准确检测指示微孢子虫是治疗的前提。

最初人们判别微孢子虫主要根据微粒子病的发病特点进行肉眼观察。显微镜发明以后，人们根据微孢子虫的形态和大小进行显微镜镜检，一定程度上提高了检测的灵敏度和效率，并因此遏制了法国等欧洲蚕桑生产国流行的家蚕微粒子病。但是显微镜镜检有明显的缺点，如对操作人员的技术及经验要求较高，而且微孢子虫个体及其微小，常用的显微镜镜检检测方法特异性和灵敏度较低，难以区分微孢子虫类似物。

随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。“分子钟”是分子水平分析生物系统进化中的有效手段，SSU rRNA（16S rDNA）是微生物进化研究中常用的“分子钟”（Pei A Y, et al., 2010）。家蚕微粒子病PCR检测技术研究中所设计的引物针对的靶基因多数也是SSU rRNA，针对其他微孢子虫基因设计的引物较少或灵敏度较差，因而很少被报道。Baker et al（1995）和Terry et al（1999）根据相近种属微孢子虫SSU rRNA高度保守区设计的PCR引物V1f/530r，可鉴别多种种属的微孢子虫的DNA模板扩增约450bp的特异目的条带，但是经常出现假阳性等问题。

微孢子虫寄主域广泛，不仅可侵害各种昆虫，也可侵染水产生物、陆生的哺乳动物。微孢子虫感染人后，造成人角膜炎、脑炎、肠炎以及腹泻等疾病。而同一种物种也可能会被不同种属微孢子虫同时感染。因此，在实际工作中，尤其是检验检疫工作，对于样品中存在多种微孢子虫病原的同时检测是很重要的，且不能出现漏检的情况，因此寻求一种既能够通用的检测多种微孢子虫，又具有很好的检测灵敏性的引物组，在微孢子虫及微孢子虫病的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有昆虫微孢子虫通用检测技术的缺陷和不足，提供一种家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其在微孢子虫检测方面的应用。

本发明另一目的是提供一组微孢子虫通用检测引物及其应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明获得了家蚕微孢子虫Met-AP2基因，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述家蚕微孢子虫Met-AP2基因编码的具有生物活性的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了所述家蚕微孢子虫Met-AP2基因在微孢子虫检测方面的应用。在获得家蚕微孢子虫Met-AP2基因的基础上，以Met-AP2基因为靶基因设计引物进行PCR扩增，根据扩增DNA片段的结果判定样品中是否含有微孢子虫。

另外，本发明还提供了一组微孢子虫通用检测引物，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

上述引物是以Met-AP2基因为靶基因设计，经过大量的实验和研究获得的，该引物既能够通用的检测多种微孢子虫，又具有很好的检测灵敏性，在微孢子虫的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。所述引物尤其适用于同时检测多种桑园及野外常见的昆虫微孢子虫，如家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫或柞蚕微孢子虫等。

本发明还提供了一种微孢子虫通用检测试剂盒，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述试剂盒的使用方法如下：

以样品DNA或cDNA为模板，利用引物MC-R和MC-F进行PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物判定结果，当琼脂糖凝胶上出现特异性地1077bp的DNA片段产物，即该样品感染了微孢子虫。