[发明专利]用萃取反萃分离纯化楸树内生真菌发酵液中楸灵素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，涉及一种从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法及其应用，具体涉及一种用萃取反萃分离纯化楸树内生真菌发酵液中楸灵素的方法。

背景技术

内生真菌是指那些生活在于植物组织内部并不会使植物产生明显病害的真菌。内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，具有巨大的潜在价值，可以成为新型抗癌药物的来源。本课题组已从胡桃楸里分离提取了一株具有很强抗癌活力的内生真菌(CCTCC M 208102)，初步鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属，其发酵提取液对肝癌细胞有很强的抑制作用。这是一个本实验室独有的全新菌种，其具有抗癌能力的发酵液制备方法已经获得专利保护(ZL200810041214.8)。由于发酵液中同时存在大量培养基成分残留和发酵产物等杂质，造成发酵液中生物活性成分楸灵素的纯度较低。需要开发一种低成本的从发酵液中初步纯化楸灵素的方案，才能和后续的楸灵素精细分离方案一起构成经济高效的楸灵素分离纯化技术路线。

针对上述技术问题，本发明充分利用楸灵素的弱酸性特质，在不同pH环境下调节其电离平衡，从而调节楸灵素的疏水性，采用乙酸乙酯为油相建立萃取反萃工艺，对楸树内生真菌发酵液中的楸灵素进行分离纯化，将楸灵素的纯度提高10倍以上，能大幅度改善后续的楸灵素精细分离过程，是高效分离纯化楸灵素的基础和关键技术。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种用萃取反萃分离纯化楸树内生真菌发酵液中楸灵素的方法，所述方法是一种采用不同pH下乙酸乙酯萃取和反萃过程从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法，该方法不仅可以实现楸灵素的浓缩分离，也可用于其他弱酸性物质的浓缩分离。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一、调整楸树内生真菌发酵液pH为4～6；

步骤二、用稀酸溶液预饱和处理乙酸乙酯，使得乙酸乙酯的pH和所述发酵液匹配；

步骤三、将所述步骤一所述楸树内生真菌发酵液与经步骤二所得乙酸乙酯混匀，静置进行双液相萃取，收集乙酸乙酯相；

步骤四、将所述收集到的乙酸乙酯相和pH为7～11水相混匀，进行反萃取，回收水相即为纯化的楸灵素水溶液。

优选地，所述楸树内生真菌发酵液按照专利ZL200810041214.8所述方法制备。

优选地，步骤一中，所述楸树内生真菌发酵液的pH为4.5～5.5。

优选地，步骤二中，所述稀酸溶液为稀盐酸溶液；进一步地，所述稀酸溶液为pH4～6的稀盐酸水溶液。

优选地，步骤二中，所述预饱和处理过程中，预饱和处理的次数大于等于1，每次预饱和处理的时间为30min。

优选地，步骤二中，所述匹配包括相等或相近。

优选地，步骤四中，所述水相的pH为8～10。

优选地，步骤四中，所述反萃取过程中持续加入碱液维持pH恒定。

优选地，所述水相和碱液中调节pH的有效组分为氨水。

步骤三中楸树内生真菌发酵液与乙酸乙酯的体积比、步骤四中乙酸乙酯相与水相的体积比均可根据技术人员实际需求而定；提高步骤三中乙酸乙酯相用量可以提高楸灵素收率，减低其纯化选择性；降低步骤四中新碱水用量可以最大限度提高楸灵素的浓缩比，但引起楸灵素收率轻微下降。

第二方面，本发明涉及一种从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法的应用，所述应用具体为，用于溶液中溶质的浓缩、分离。

优选地，所述溶液的溶剂包括水。

本发明所述乙酸乙酯萃取反萃分离纯化楸灵素的原理如下：楸灵素作为一种弱酸性物质，在水溶液中部分电离产生带正电的氢离子和带负电的楸灵素酸根离子，形成电离平衡。因此水溶液中楸灵素有两种存在形式，相对疏水的不带电的楸灵素分子形式和相对亲水的带负电的楸灵素酸根离子形式。调节水溶液的酸碱性可以影响楸灵素电离平衡，从而调节楸灵素在疏水性分子状态和亲水性负离子状态间的分布。

在酸性条件下，不利于楸灵素电离，楸灵素电离程度降低，主要以疏水性分子状态存在，因此在和乙酸乙酯进行双液相萃取时倾向于从发酵液水相进入乙酸乙酯油相。而亲水性杂质则保留在发酵液水相而被分离去除。

而在碱性条件下，利于楸灵素电离，楸灵素电离程度提高，主要以亲水的酸根负离子形式存在，因此含有楸灵素的乙酸乙酯在和碱水进行反萃取时，楸灵素倾向于从乙酸乙酯相进入新的碱水相，而疏水性杂质则保留在乙酸乙酯相而被去除。