[发明专利]一种高时空分辨光学检测与显微成像方法与装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种高时空分辨光学检测与显微成像方法与装置。

背景技术

成像技术是当前乃至今后相当长一段时期生命科学，包括生物学医学及其相关交叉学科研究中的重用技术和手段，其地位犹如基因重组和DNA测序技术一样重要。特别地，以活细胞、单分子为主要研究对象的分子影像新技术，近年来在细胞和分子水平上对生物过程开展在体测量与表征上不断取得新的发展与突破，其发展趋势是更高的空间分辨率、更快的速度以及动态生物信息获取等。光学成像技术由于具有无损伤、非侵入性、快速获取等特点，在活细胞成像方面具有其它技术无法替代的优势，因此，光学显微成像新技术成为当前分子影像新技术发展的前沿与热点。

由于受到光学衍射极限的限制，传统光学显微镜只能达到波长量级的横向空间分辨率(约为200多纳米)，该尺度远大于蛋白质等生物分子的尺寸；为了突破此空间分辨率限制，近年来，各国科学家发展了多种超越衍射极限的荧光光学显微成像技术，如受激辐射耗损显微术(STED)、光激活定位显微术(PALM)和随机光学重构显微术(STORM)等。这些超越衍射极限分辨能力的光学显微成像技术目前有的已经可以达到10-50nm的横向空间分辨能力，从而可以对诸如细胞突触囊泡的输运和胞呑或胞吐等重要生物学问题开展研究。然而，虽然这些光学超分辨成像技术已经具备了分子水平的空间分辨能力，但它们只是提供细胞生命活动过程某一时刻的静态状态，即使是每秒可达14帧以上的视频图像，也仅是分子一系列动力学过程的综合反映，而无法揭示或显示分子之间实时、快速的相互作用过程，因为这些过程的时间尺度一般是ms量级或者更快。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有超越衍射极限空间分辨能力和时间快速获取的高时空分辨光学检测与显微成像方法与装置，实现对活细胞膜上特定微区（几十纳米）中相关分子事件如分子间相互作用过程等进行实时、动态的观察和研究。

为了实现上述目的，本发明提出了一种技术方案：一种高时空分辨光学检测与显微成像装置，包括：

一激光器系统，用来产生和发射一束或两束的激光光束；

一光束传输和控制相关光电元器件，其包含第一光路光电元器件、第二光路光电元器件以及两光路耦合传输光电元器件组成，所述第一光路光电元器件用来传输和控制第一光路的激光光束，所述第二光路光电元器件用来传输和控制第二光路的激光光束，所述两光路耦合传输光电元器件用来耦合和传输两路的激光光束；

一光学显微镜，利用一路或耦合后的两路激光光束照射样品、检测与成像；以及

一微弱信号光电探测器件，用来对图像中预定区域实现单通道或双通道的时间相关光谱计数与检测。

进一步的，所述第一光路光电元器件包括沿第一光路传输方向依次设置的光开关、第一1/2玻片、偏振分光片、脉冲展宽部件、第一反射镜、时间延迟单元、第二反射镜、第二1/2玻片、偏振片、第三反射镜、会聚透镜、单模保偏光纤、低倍率物镜、第五反射镜以及涡旋相位板。

进一步的，所述第二光路光电元器件包括沿第二光路传输方向依次设置的光学参量振荡器、第四反射镜以及陷波滤光片。

进一步的，所述两光路耦合传输光电元器件包括沿两光路耦合传输方向依次设置的第一二色镜、第六反射镜、第三1/2玻片、1/4玻片以及第二二色镜，所述第一光路的激光光束经第一二色镜透射至第六反射镜，所述第二光路的激光光束经第一二色镜反射至第六反射镜。

进一步的，所述光学显微镜由样品台、成像物镜、激光扫描单元、第三二色镜、第三带通滤光片以及光电倍增管组成，所述第二二色镜反射出的激光光束进入激光扫描单元，并经第三二色镜反射后，通过成像物镜照射在样品台上面的样品上；所述样品上出射的后向双光子荧光信号返回通过成像物镜，并经第三二色镜透射后，通过第三带通滤光片被光电倍增管所检测成像。

进一步的，所述微弱信号光电探测器件包括路由器、第一带通滤光片、第二带通滤光片、第一光电探测器、第二光电探测器、时间相关光子计数器以及数据采集与分析设备，所述第一带通滤光片和第一光电探测器组成了第一通道，所述第二带通滤光片和第二光电探测器组成了第二通道。

为了实现上述目的，本发明提出了另一种技术方案：一种高时空分辨光学检测与显微成像方法，包括以下两种工作模式：