[发明专利]一种快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法

说明书

(一)技术领域

本发明所涉及的是一种用于快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法，属于病毒分子生物学领域。

(二)背景技术

水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病病毒(Aleutian mink disease parvovirus,AMDV)引起的水貂的一种慢性消耗性、超敏感性和自身免疫性疾病，以终生毒血症、全身淋巴细胞增殖、血清γ-球蛋白增多、肾小球肾炎、动脉血管炎和肝炎以及持续性病毒血症为特征的一种慢性病毒病。本病在世界各养貂国家均有发生，所有品系的水貂均能感染，具有阿留申基因型的水貂死亡率可达30％。本病还能使母貂空怀率和仔貂死亡率显著升高，公貂的交配能力下降，还能影响发育而使毛皮品质低下，同时造成动物机体抵抗力下降，易于继发或混合感染其他疾病，造成经济损失，是世界公认的养貂的重大疫病之一。目前本病尚无适用的疫苗可作特异性预防，也无良好的治疗方法，主要的防控措施是检疫淘汰。水貂慢性传染性疾病,主要侵害水貂的免疫系统,以浆细胞弥漫性增生和持续性病毒血症为特征。近年来，AMD在有水貂饲养的国家普遍存在,AMD导致水貂的繁殖力和毛皮质量严重下降,对养貂业造成不可弥补的经济损失。

目前在实际生产中，主要采用碘凝集试验(IAT)、对流免疫电泳法(CIEP)等方法对阿留申病毒鉴定，费事费力而且会起因其他干扰因素出现假阳性，对于多重感染的鉴定难以进行。双重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感高、特异强等优点，已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用。但PCR方法鉴定的基础是依据病原的基因型来进行的，目前的研究表明，AMDV基因组有两个大的开放阅读框架LORF和RORF，负责编码病毒的相关蛋白，其中RORF编码结构蛋白VP1和VP2，LORF主要编码非结构蛋白NS1和NS2。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用，VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和病毒，NS1和NS2对病毒在宿主细胞中的复制起重要的调节作用。因此可以通过结构蛋白和非结构蛋白设计两对引物对AMDV进行检测。目前，在我国水貂群中AMD普遍存在，应用双重PCR方法检测AMDV的方法还没有建立，所建立的检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法具有省时省力、特异性强、敏感性高的高通量检测方法，为该病的检疫提供一种新的检测方法。

(三)发明内容

本发明提供了一种快速检测水貂阿留申病毒的双重PCR方法。本发明设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立了检测AMDV的双重PCR方法，特异性更强、敏感性更高，可以快速准确地进行AMDV的检测。

一种快速检测AMDV的双重PCR方法，包括以下步骤：

A、通过对GenBank上已发表的AMDV的基因序列进行比对，选择在AMDV的非结构蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4。

SEQ.ID.NO 1：5’-AACACCGCCACTGAGGAC-3’；

SEQ.ID.NO 2：5’-CGTTACCAGCAGCAAAGT-3’；

SEQ.ID.NO 3：5’-ACGCATCTACCAAGCAAT-3’；

SEQ.ID.NO 4：5’-AGGAGGTAGCCCTAAGCA-3’。

所有引物以无菌ddH₂O(Rnase free)配成20pmol/μl的浓度备用。

B、以AMDV DNA为模板进行PCR反应。反应体系为：15.3μl ddH₂O(Rnase free)，2.5μl Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μl DNA模板，0.2μl Taq酶。PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 40s，50℃ 40s，72℃ 40s，32个循环；72℃ 10min。

C、对步骤B得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：

如果同时扩增出了568bp和412bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有AMDV；如果未扩增出568bp和412bp的产物，则该样品不含有AMDV。