[发明专利]一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒。

背景技术

喹诺酮类是近年来临床引用较广的一种新型广谱抗菌剂，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类和其他抗菌药的作用点不同，它们以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶。细菌的双股DNA扭曲成为袢状或螺旋状(称为超螺旋)，使DNA形成超螺旋的酶称为DNA回旋酶，喹诺酮类妨碍此种酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，而使细菌细胞不再分裂。

喹诺酮类抗生素在临床上不仅对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，而且对革兰阳性菌也有较强的抗菌作用。由于具有抗菌作用强、感染部位浓度高、不良反应轻微、血半衰期长、使用方便、患者耐受性好及价格相对较低等特点，使其在细菌性感染治疗中具有一定的优势。普遍用于伤寒、急性细菌性痢疾、单纯尿道感染、急性淋病性尿道炎、急性呼吸道感染、军团病、肺结核等。另外，近年来喹诺酮类抗生素在儿科领域也得到了广泛应用，此外，喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的药物。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖中用于疾病防治。

近30年来，由于大量治疗用抗生素在临床的不合理应用，临床疾病相关细菌的耐药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。耐药菌能够承受住抗生素药物的攻击，这样一来标准的治疗就失去了效果，感染持续存在并可传染他人。喹诺酮类抗菌药由于其高效的抗菌活性，已被越来越多的使用于临床，这当中不免有抗生素滥用的情况，并且其耐药机制多样，使得此类药物的耐药性问题也日益突出。另外，因为在畜牧养殖业中广泛使用喹诺酮类抗生素的情况非常普遍，不仅动物、禽类及鱼类体内残留的抗生素会转移到人体，它们体内产生的耐药菌和耐药基因也会传播给人类。这样就需要一种能方便快捷的检测细菌耐药性的方法，从而来及早发现耐药细菌，进而改变用药方案，指导临床治疗。

耐药性的检测可以分为常规表型检测(即药敏试验)和耐药基因型检测。常规药敏试验首先需要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株，而许多生长较慢和不易培养的细菌，是无法通过常规药敏试验检测其耐药性的。在过去的2O年，为适应临床需要，以DNA探针和聚合酶链反应(PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方法已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床工作。从最初的定性PCR和电泳到后期的基因芯片等技术都可以检测细菌抗生素相关耐药基因，但定性PCR及电泳法具有容易污染、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术可同时检测多个耐药基因，但成本也非常高，操作复杂，所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂盒，实现对常见细菌喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS的快速检测，以弥补现有检测方法的不足。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物，它包括如下引物：

(1)扩增qnrA耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)扩增qnrB耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；

(3)扩增qnrS耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示；

上述3对引物对在一次检测中共同使用。

上述检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物在制备检测细菌喹诺酮类耐药基因试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：