[发明专利]可检测与区分不同种羊巴贝斯虫的引物对与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测与区分动物血液原虫病的试剂盒。确切讲本发明涉及一种不仅能用于检测，而且能准确区分我国分布的两种感染羊的巴贝斯虫，即莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对及检测试剂盒。

背景技术

羊的巴贝斯虫病是一种经蜱传播的血液原虫病，由绵羊巴贝斯虫、莫氏巴贝斯、粗糙巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种等引起，使感染动物出现发热、黄疸、贫血、血红蛋白尿、甚至死亡。该病在热带、亚热带、温带均有流行，给世界畜牧业造成严重的危害。其中绵羊巴贝斯虫(Babesia.ovis)与莫氏巴贝斯虫(B.motasi)是引起羊巴贝斯虫病的主要病原；绵羊巴贝斯虫虫体小，对小反刍动物致病力高，传播媒介是囊形扇头蜱(Uilenberg et al., 1980)。莫氏巴贝斯虫虫体较大，刻点血蜱为其传播媒介(Alani and Herbert, 1988; Uilenberg et al.,1980)。粗糙巴贝斯虫(B.crass)是一种大型的非致病性的巴贝斯虫，与莫氏巴贝斯虫和绵羊巴贝斯虫在形态、血清学、分子进化方面有很大差异(Hashemi-Fesharki and Uilenberg, 1981; Schnittger et al., 2003)。

在我国，羊的巴贝斯虫病最早在1982 年 和1986年由陈德明和赵锡荣等分别在四川和黑龙江省发现并报道，当时并未引起兽医防治部门的重视。自1997年以来，笔者所在实验室，即中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫与虫媒病团队先后对我国部分省区羊的巴贝斯虫病进行了选点调查，采用血液接种和蜱传播试验的方法先后自辽宁、 河北、 甘肃和新疆等省份分离获得了羊的巴贝斯虫不同地方株，并发现这些地区该病流行比较严重，病原对外地引进良种羊致病性较强，严重制约了羊的品种改良。依据真核生物核糖体 18S rRNA 和 ITS 基因的特点，设计合适的引物，对这些地方分离株进行测序分析，序列比对结果显示：这些感染羊的巴贝斯虫可分为两组；一组为莫氏巴贝斯虫（包括莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫宁县株、莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫麻当株和莫氏巴贝斯虫河北株），另一组为羊巴贝斯虫未定种新疆株(Guan et al., 2009; Liu et al., 2007b; Niu et al., 2009a)。另外，经传播实验证实，莫氏巴贝斯虫宁县株和临潭株的传播媒介为青海血蜱和长角血蜱(Bai et al., 2002; Guan et al., 2010c)；羊巴贝斯虫未定种新疆株的传播媒介为小亚璃眼蜱。这三种蜱在我国广范分布(Chen et al.,2010; Yin and Luo,2007; 陈泽等,2008; 邓国藩, 1960)；同时，还建立了各种分子生物学和血清学检测技术，通过流行病学调查显示，在中国，羊巴贝斯虫病的感染率为１１．２％～３１．７％，在甘肃甘南牧区高达８２．３８％（Guan et al, 2012）。且我国分离的感染羊的巴贝斯虫，即莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株在流行区内常呈混合感染或隐性感染状态，不同病原之间的鉴别诊断一直是困扰该病流行病学调查的技术瓶颈。

目前常用的诊断该病的方法为血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。还有很多血清学方法，但都存在一定的假阳性或假阴性以及交叉反应。分子生物学诊断方法有套式PCR检测方法, LAMP检测方法(Guan et al., 2010e；Guan et al, 2012)，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染，LAMP检测过程中容易出现假阳性。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术的不足，能快速、特异、灵敏的检测绵羊、山羊和自然媒介蜱体内羊巴贝斯虫感染，而且能准确区分我国分布的两种感染羊的巴贝斯虫，即莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对及试剂盒。

本发明的可用于检测羊莫氏巴贝斯虫的引物对基因序列为：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。本发明的可用于检测羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对基因序列为：SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。