[发明专利]一种作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生化检测方法，具体涉及一种作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量测定方法。

背景技术

脂肪氧化酶(LOX)是一种含非血红素铁的蛋白质，专一催化具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应，氧化生成具有共轭双键的过氧化氢物。脂肪氧化酶具有三种同工酶Lox-3、Lox-2、LOX-1它们广泛存在于高等植物体内，与植物的生长发育、植物的衰老、脂质过氧化作用和光合作用、损伤反应及其他胁迫反应等有关。Lox在成熟的大豆种子中含量很高(占种子蛋白质含量的1％～2％),可催化不饱和脂肪酸的加氧反应,形成过氧化氢衍生物等挥发性物质,能直接与食品中的蛋白质和氨基酸结合,产生豆腥味和苦涩味,降低食品的风味和营养价值,而且破坏了上述几种人体必需脂肪酸,是大豆中的抗营养因子。

脂肪氧化酶的活力直接影响大豆、花生、水稻等作物种子贮藏期限和加工品质，活力越小其对种子的影响就越小。科研工作者已经在研究选育培养出脂肪氧化酶Lox缺失的农作物新品种，因此如何快速准确地定量检测出脂肪氧化酶Lox活性，能为研究者提供更加准确地检测数据，从而提高工作效率，加快新品种的研究步伐，同时也为农作物贮藏、收购提供准确实用的数据。

发明内容

本发明提供了一种作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量测定方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将作物胚胎磨碎，加入提取液，研磨成匀浆,将匀浆装入超声波萃取釜中，将超声波发射频率设定在30-40KHz，温度调节控制在20-25℃，萃取时间5-8分钟，然后转至具盖离心管，再用提取液洗涤3-4次，洗涤液转至具盖离心管，脱色摇床振荡8-10min，8000rpm离心8-10min，静置3-5min，取上层清液，即酶液；

(2)取提取的酶液于比色皿中，加入适量的反应液，在660nm处测定吸光值，反应开始时记录吸光值，取出反应体系，至离心管，室温25℃避光反应，测定60min后的吸光值并记录，以吸光值的变化表示LOX-1活力，用纯水作为参比调零，以缓冲液代替酶液作为对照；

(3)测定酶液蛋白浓度：

取适量酶液，先测定样品280nm OD值和260nm OD值，再按照以下公式计算酶液蛋白浓度：

酶液蛋白浓度(mg/mL)＝280nm OD值*1.45-0.74*260nm OD值；

(4)计算酶比活力：

按照酶比活力测定公式计算出酶比活力，

酶比活力＝(样品0min的OD值-样品60min的OD值)-(对照0min的OD值-对照60min的OD值)/酶液蛋白浓度。

所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量测定方法，其特征在于：所述的作物为水稻或花生。

所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量测定方法，其特征在于：所述的提取液的配制方法为：取甘油10-15ml，Tween-20 2.0ml，用pH9.0的硼酸缓冲液定容至100ml，混匀，静置数天后使用，即为提取液；

所述的pH9.0硼酸缓冲液的制备：硼酸12.37g/L，0.2mol/L；硼砂19.07g/L，0.05mol/L，取2.474g硼酸，15.256g硼砂，加水溶解，定容至1000ml即可。

所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量测定方法，其特征在于：所述的反应液的制备方法为：将pH9.0硼酸缓冲液、亚油酸纳、100μM亚甲基兰、水，按照5:1:0.5:1(v/v)的比例混合，得LOX-1反应液，所述的亚油酸钠的配制方法：定量称取70mg亚油酸，再加入等量Tween-20，再加入4ml无氧水，充分混匀，在加入0.5N的NaOH约0.55ml至溶液变澄清，再定容至25ml，等量，分装至-20℃冷藏，待用。

本发明的原理：利利用脂肪氧化酶LOX-1能偶联氧化亚甲基蓝产生变色反应，该反应在660nm处有一吸收峰，测定其吸光值的变化率可以反映其催化速率。

本发明的有益效果：本发明方法能快速、准确、定量地检测出脂肪氧化酶LOX-1比活力，其过程简单，成本低，其精确度明显优于已有的相关检测技术；能为研究者提供更加准确地检测数据，能提高工作效率，加快LOX-1缺失的新品种选育步伐，同时也为农作物贮藏、收购提供更加准确实用的数据。

具体实施方式

1、配制反应液、提取液