[发明专利]一种重组糖苷水解酶用于生物转化制备人参二醇型皂苷的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种制备人参皂苷的方法。

背景技术

人参二醇型皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2，被报道具有良好的药理学活性，例如抗肿瘤活性、抗炎活性等，具有一定的应用潜力。但是这些人参皂苷在天然人参中含量甚微甚至根本不存在，从天然人参中进行提取分离十分困难，这极大地限制了它们的应用。

在人参总皂苷中，二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的含量，超过人参总皂苷含量的60％以上。对比人参皂苷Rb1与Gyp XVII、Rb2与compound O、Rc与Mb、Rd与F2的结构可知，它们的皂苷元结构相同，只是连接在C-3位置上的糖基数目有所不同。因此，可以通过水解人参二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的C-3位的外侧葡萄糖基，来分别得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2。

以往有研究者通过部分酸水解人参总皂苷来制备一些糖基数目较少的人参皂苷。但酸水解的稳定性差，不同批次之间质量不稳定。此外，酸水解的专一性差，容易产生副产物，造成了目标产物的产率偏低，且后续的产品分离纯化比较困难。也有研究者利用细菌、真菌等微生物分泌的糖苷水解酶来生物转化人参总皂苷、人参二醇型皂苷混合物或某种人参二醇型皂苷单体，制备Gyp XVII、compound O、Mb和F2，或其中的一种或几种。生物转化与酸水解相比，具有条件温和、专一性好等优越性。但是由于细菌或真菌分泌的糖苷水解酶数量较少，而且微生物容易变异、退化，造成了这一生物转化过程的效率很低，这一生产过程不适合放大，给生产过程增添了不稳定性，不适用于工业规模的应用。现在急需通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，实现人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的稳定制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法。

本发明提供的制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法，包括以人参二醇型皂苷为底物用蛋白质进行催化反应得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2反应物的步骤，所述蛋白质的名称为CcBgl1A，来源于纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

b)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有人参皂苷水解酶活性的蛋白质；

d)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有人参皂苷水解酶活性的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由390个氨基酸残基组成，是天然人参皂苷水解酶CcBgl1A(名称为N CcBgl1A)的氨基酸序列；SEQ ID No.4由410个氨基酸残基组成，是重组人参皂苷水解酶CcBgl1A(名称为R CcBgl1A)的氨基酸序列；SEQ ID No.4是在SEQ ID No.2的氨基末端添加氨基酸序列：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH得到的氨基酸序列。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。上述d)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述d)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上SEQ ID No.3所示的His-Tag的编码序列得到。

上述方法中，所述方法包括从所述反应物中纯化得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的步骤。

上述方法中，所述以人参二醇型皂苷为底物用CcBgl1A进行催化反应在液体中进行，所述液体中CcBgl1A和所述人参二醇型皂苷的配比为1IU CcBgl1A：0.5-2mg所述人参二醇型皂苷(如0.8IU CcBgl1A：1mg所述人参二醇型皂苷)，所述IU为CcBgl1A的β-葡萄糖苷酶酶活。