[发明专利]一种测定人ABCC2基因多态性的方法

权利要求书

1.一种测定人ABCC2基因多态性的方法，其特征在于，其包括，待测样品经基因组DNA提取，经PCR扩增后，用高分辨率熔解仪检测基因分型，用高分辨熔解曲线分析基因多态性；

通过以下步骤：

(1)查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；

(2)提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤(1)筛选的引物进行基因扩增；

(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型。

2.按权利要求1所述的测定人ABCC2基因多态性的方法，其特征在于，

通过以下步骤采用高分辨熔解曲线分析人ABCC2c.1249G>A和ABCC23972C>T基因多态性：

(1)查找目的基因ABCC2c.1249G>A和ABCC23972C>T的DNA序列，针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；

(2)提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用上述步骤(1)筛选的引物进行基因扩增；

PCR扩增反应的条件为92-97℃预变性3-15min，92-97℃变性10-30s，50-65℃退火10-30s，72℃延伸10-30s，70-75℃继续延伸3-10min，30-50个循环；基因扩增后采用琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物是否为特异性扩增；

(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测，选用SYTO-9饱和荧光染料，应用Rotor-GeneQ软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型；

所述进行突变位点检测的条件为92-97℃变性2-5min，40℃复性1-2min；然后初始熔解温度60-65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25-45次每秒；然后40℃进行冷却5-15s。

3.按权利要求2所述的测定人ABCC2基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，引物对含有目的基因靶序列中18-27个bp连续核苷酸构成的序列，PCR产物长度80-150bp；

所述ABCC2c.1249G>A(rs2273697)引物序列如SEQ.IDNO1.和SEQ.IDNO2.所示；

所述ABCC23972C>T(rs3740066)引物序列如SEQ.IDNO3.和SEQ.IDNO4.所示。

4.按权利要求2所述的测定人ABCC2基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，基因扩增在20μLPCR反应体系中进行，该反应体系包括引物、DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、模板DNA、PCR缓冲液和荧光染料；选用TaKaRaPremixTaq试剂盒包含Taq^TMHS、PCR缓冲液(含Mg²⁺)、dNTPs，反应体系终浓度组成为：

5.按权利要求4所述的测定人ABCC2基因多态性的方法，其特征在于，所述dNTPs混合液包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP的混合液。

6.按权利要求2所述的测定人ABCC2基因多态性的高分辨熔解曲线分析方法，其特征在于，所述PCR反应体系各组分体积：

20μLPCR反应体系如下：

。

7.按权利要求2所述的测定人ABCC2基因多态性的方法，其特征在于，所述熔解曲线温度设定范围分别：ABCC2c.1249G>A为79-86℃、ABCC23972C>T为83-90℃。