[发明专利]一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，本发明尤其涉及一种检测纤维蛋白原AαThr312Ala(A/G)SNP的试剂盒，本发明还涉及一种检测纤维蛋白原SNP的方法。

背景技术

慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH)是指一次或反复发生的血栓栓塞导致血栓机化、肺血管管腔狭窄甚至闭塞，长期不能缓解，导致肺血管阻力增加，肺动脉压力进行性增高，最终导致右心室肥厚和右心衰竭的综合征。目前报道，肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism，PTE)后继发CTEPH的比率为0.5-8.8％，估测发病率至少在4％。我国PTE的发病率约为0.23％，即我国至少有300万PTE患者，因此我国约有12万左右的CTEPH患者。CTEPH病死率极高，有报道称，在平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)>50mmHg的CTEPH患者，其5年生存率不足14％。也有人报道，若mPAP>50mmHg，则5年生存率约10％，危害超过多种恶性肿瘤。

多数研究结果提示PTE患者体内的血栓未能及时溶解而持续存在，最终导致了CTEPH的发生。血栓形成的底物及血栓主要成分的来源均为纤维蛋白原，因此纤维蛋白原基因或表达的异常等均可影响血栓的溶解。我们课题组通过病例对照研究，发现纤维蛋白原AαThr312Ala(A/G)此SNP位点与CTEPH的发病密切相关，该研究已于2013年发表于Plos One杂志。这为早期发现CTEPH提供了一个重要的分子标记物。

目前检测SNP的技术有“金标准”——测序法、大批量的基因芯片法以及传统的限制性片度长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的方法。测序法最为准确，但费用过高而不宜广泛应用于患者的常规临床检测。大批量的基因芯片法因位点的不同而难于一起检测，且因CTEPH临床检测的标本数相对较少而容易造成如下后果：或者浪费芯片而造成费用过高，或者浪费时间而造成患者等待检测结果的时间过长。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，解决了现有技术中存在的费用过高或耗时过长的问题。

本发明所采用的第一技术方案是，一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，包括2.500μl的10×DNA聚合酶缓冲液，2.000μl的dNTP混合物，0.125μl的DNA聚合酶，1.000μl的上游引物，1.000μl的下游引物，1.0ug的基因组模板DNA，1μl的ScaI，2μl的ScaI buffer，1μl的DNA上样缓冲液；其中，上游引物为5’cag agt gga agg cattaa cag a 3’；下游引物为5’gggttttgg ttt cca gta ctt c 3’。

本发明所采用的第二技术方案是，一种检测纤维蛋白原SNP的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、基因组DNA提取：用购自天根生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒，从0.75ml人体血细胞中提取基因组DNA；

步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；

步骤3、将酶切产物进行琼脂糖凝胶中电泳，对基因型进行判定。

本发明的特点还在于，

步骤2中PCR体系为2.500μl的10×DNA聚合酶缓冲液、2.000μl的dNTP混合物、0.125μl的DNA聚合酶、1.000μl的上游引物、1.000的下游引物、1.0ug的基因组模板DNA，补充去离子水至25.000μl。

步骤2中25.000μl PCR体系的程序设定如下：94℃5min；94℃40s→52℃40s→72℃40s，25个循环；72℃10min。

步骤2中使用的特异性引物为上游引物和下游引物，由Sigma公司合成，序列如下所示：上游引物5’cag agt gga agg cat taa cag a 3’；下游引物5’ggg ttt tgg ttt cca gta ctt c 3’。

步骤3在酶切体系中进行，所述25.000μl的酶切体系为：20μl的PCR产物、1μl的ScaI、2μl的ScaI buffer、补去离子水至25.000μl。