[发明专利]一种鱼精蛋白专用编码基因及其应用

权利要求书

1.一种鱼精蛋白专用编码基因，其特征在于：该编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种利用权利要求1所述编码基因制备鱼精蛋白的方法，其特征在于：该方法包括如下具体操作：

(1)将权利要求1所述编码基因与载体pET22b连接后转化入BL21感受态，获得工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro；

(2)挑取工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro单菌落并接种入含Amp100μg/ml的LB培养基中培养16h，之后按1:100的体积比转入含Amp100μg/ml的乳糖诱导培养基中，诱导培养20h，接着于4℃、6000rpm条件下离心20min，然后收集菌体，并置于-80℃下保存；

(3)将步骤(2)收集到的菌体经-80℃和4℃反复冻融三次裂解菌体，加入破菌液，且每1克菌体加入10毫升破菌液，并于4℃，10000rpm下离心20min，离心结束后分别收集沉淀和上清液，融合蛋白CYGB-Pro大部分位于沉淀中；接着采用洗涤液洗涤沉淀两次，之后用溶解液溶解洗涤后的沉淀，得溶解液；将溶解液经Ni Sepharose亲和层析进行纯化洗脱，所用洗脱液的组分为0.5M NaCl、20mM NaH₂PO₄、500mM Imidazole、8M Urea、pH＝7.4，最终洗脱液中的蛋白即为纯化后的融合蛋白CYGB-Pro；

(4)将步骤(3)所得纯化后的融合蛋白CYGB-Pro进行CNBr裂解，具体地：将纯化后的融合蛋白CYGB-Pro，置于通风橱中操作，加入终浓度为0.2M的浓盐酸、终浓度为50mg/ml的CNBr，避光、室温裂解24h，之后加入等体积的ddH₂O灭活CNBr；然后采用流速为3mL/min的G-25分子筛进行脱盐纯化，即得所述鱼精蛋白，且脱盐纯化采用的平衡液和洗脱液均为去离子水。

3.根据权利要求2一种编码基因制备鱼精蛋白的方法，其特征在于：所述破菌液的组分：0.5M NaCl，20mM NaH₂PO₄，1mM EDTA，0.5％Triton X-100，pH 7.4；洗涤液的组分：0.5M NaCl，20mM NaH₂PO₄，2M Urea，0.5％TritonX-100，1mM EDTA，pH 7.4；溶解液的组分：0.5M NaCl，20mM NaH₂PO₄，50mM Imidazole，8M Urea，1mM DTT.pH＝7.4。

4.根据权利要求2一种编码基因制备鱼精蛋白的方法，其特征在于：所述Ni Sepharose亲和层析的条件中为：Binding Buffer为0.5M NaCl，20mMNaH₂PO₄，50mM Imidazole，8M Urea.pH＝7.4；Elution buffer为0.5M NaCl，20mM NaH₂PO₄，500mM Imidazole，8M Urea.pH＝7.4。

5.根据权利要求2一种编码基因制备鱼精蛋白的方法，其特征在于：所述LB培养基：10g/L Tryptone，5g/L Yeast Extarct，10g/L NaCI；乳糖诱导培养基：15g/L Tryptone，12g/L Yeast Extarct，3g/L NaH₂PO₄·2H₂O，7g/LK₂HPO₄·3H₂O，2.5g/L NaCI，0.2％葡萄糖，2.1mM乳糖，0.05％MgSO₄·7H₂O。