[发明专利]一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及液体酶稳定性技术领域，尤其涉及一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法。

背景技术

糖化血清白蛋白(GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的产物，即血清白蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。糖化白蛋白半衰期较短，测定糖化白蛋白的浓度可有效反映患者过去2～3周内平均血糖的水平，并不受临时血糖浓度波动的影响。目前，临床广泛采用清除游离糖化氨基酸的果糖氨基酸氧化酶(FAOD)法(下称FAOD清除法)测定GA含量，果糖氨基酸氧化酶是该方法中的关键工具酶，用于催化由糖化白蛋白酶解而来的果糖氨基酸发生氧化反应生成氨基酸、葡萄糖醛酮和过氧化氢。由于液态果糖氨基酸氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其热稳定性是该酶大量应用的基础。提高酶稳定性的主要方法有蛋白质工程、固定化、化学修饰、添加酶保护剂等。添加酶保护剂是提高液态酶热稳定性的主要方法，常见的酶保护剂有牛血清白蛋白等蛋白质类、L-天门冬氨酸等氨基酸类、蔗糖等二元糖类、甘油等多元醇等物质。这些保护剂对单独存在的液态果糖氨基酸氧化酶有一定的稳定作用，但并不适合采用FAOD清除法的GA测定试剂中果糖氨基酸氧化酶的保存。采用FAOD清除法的GA测定试剂由试剂1和试剂2组成，试剂1的主要成分为一种碱性缓冲液，含有一定浓度的果糖氨基酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、Trinder’S反应组分、防腐剂，试剂2的主要成分也是一种碱性缓冲液，含有一定浓度的碱性蛋白酶、金属离子、Trinder’S反应组分、防腐剂。该试剂在测定GA时，先用碱性蛋白酶将糖化白蛋白酶解为糖化氨基酸，然后用果糖氨基酸氧化酶进行氧化，再偶联Trinder’s反应进行显色定量。在试剂1中添加高浓度的牛血清白蛋白等蛋白质、L-天门冬氨酸等氨基酸虽然都可以在一定程度上提高果糖氨基酸氧化酶的热稳定性，但牛血清白蛋白等蛋白质本身也可被碱性蛋白酶所酶解，在检测时会降低碱性蛋白酶对血清糖化白蛋白的酶解作用，高浓度的L-天门冬氨酸等氨基酸则会阻碍碱性蛋白酶对血清糖化白蛋白的酶解反应，这两者均使酶解反应不到终点，降低检测的灵敏度和准确性；蔗糖、麦芽糖、果糖等二元糖在碱性缓冲液中长时间存储时，会逐渐水解释放出葡萄糖，葡萄糖具有较强的还原性，可明显降低检测的灵敏度；高浓度的甘油等多元醇对果糖氨基酸氧化酶有良好的稳定作用，但多元醇的还原性同样降低了检测灵敏度。现有的技术为提高FAOD清除法测定试剂中果糖氨基酸氧化酶的热稳定性，多数情况下都是加入大量的对GA检测无干扰的非专一性保护剂，未能解决液态糖化氨基酸氧化酶热稳定性不佳的缺点，另一方面，大量保护剂的加入导致测定试剂粘度较高，不利于在全自动生化分析仪上应用。

因此，需求一种不对FAOD清除法测定GA含量产生干扰、可显著提高液态氨基酸氧化酶热稳定性的方法，对于实现FAOD清除法测定GA含量的测定试剂开发显得尤为重要。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，建立一种对FAOD清除法测定GA含量无干扰、可显著提高液态氨基酸氧化酶热稳定性的方法，该方法通过在含有果糖氨基酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、Trinder’S反应组分、防腐剂的碱性缓冲液中添加一定浓度的离子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐([BSMIM]OTf)，联合非离子型表面活性剂TritonX-100和海藻糖的协同稳定作用，使液态果糖氨基酸氧化酶置4℃保存12个月仍保留足够的活性，特别适合FAOD清除法测定糖化白蛋白的测定试剂开发。

本发明采用如下技术方案：

本发明的提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法的具体步骤如下：

(1)配制含有果糖氨基酸氧化酶(来源于recombinant E.coli)、叠氮钠的pH7.5-8.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液；

(2)在低温搅拌条件下向步骤(1)所述的缓冲液中添加1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐([BSMIM]OTf)、海藻糖、TritonX-100。

步骤(1)中的pH7.5-8.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液的Tris-HCL浓度为30-100mmol/L，含有的果糖氨基酸氧化酶浓度为1-10KU/L，叠氮钠的浓度为1g/L。

步骤(2)中的低温搅拌条件是转速为200rpm的低速搅拌，温度为2-8℃。

步骤(2)中的[BSMIM]OTf与Tris-HCL缓冲液的质量体积比为2～10g/L(即1L Tris-HCL缓冲液中加入2-10g的[BSMIM]OTf)。