[发明专利]VEGFR2单链抗体与MICA融合蛋白的制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可与人血管内皮细胞生长因子受体2特异结合的高亲和力的与MICA连接的融合抗体(AK404R-MICA)，可以抑制内皮细胞的增殖、迁移、细胞侵袭和小管形成，还可以显著抑制肿瘤细胞K562的生长，是一种具有抗肿瘤活性的基因工程融合抗体。

背景技术

肿瘤细胞能够渗入淋巴管和血管并通过血流循环侵入正常的组织中，使癌症成为潜在威胁生命的疾病。肿瘤细胞的转移的一个必备条件就是血管的新生。然而，新生血管的形成的关键之一就是血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族和相关受体，它通过与血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合激活细胞内信号通路，刺激血管内皮细胞增殖、迁移，促进新生血管的生成，与机体多种常见肿瘤的发病及肿瘤的转移有着密切的关系。VEGFR-2，在人体内又称为KDR(Kinase Insert Domain Receptor)，与VEGF具有较高的亲和力，它在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用。。KDR属酪氨酸激酶受体(Receptor protein-tyrosine kinase)，2～3区和VEGF的结合有关，2和4区主要影响其与VEGF的分离，1区主要负责调节受体与配体的结合，4～7区中可能存在抑制与VEGF结合的位点，其中3区(即KDR3，含有97个氨基酸)对VEGF的结合贡献最为突出。

主要组织相容性复合物工链分子A(Major Histocompatibility Complex class I-related chain molecules A，MICA)，是一种高度糖基化的由MHC基因编码的跨膜糖蛋白，在免疫监视中起重要作用，MICA为天然杀伤(NK)细胞活化受体NKG2D的配体，研究表明，表达MICA的肿瘤细胞普遍对NK细胞杀伤较为敏感。自然杀伤细胞表面受体2D(NKG2D)，是C型凝集素超家族中的一员，不仅表达于所有的NK细胞，且表达于CD8+T细胞、活化的巨噬细胞表面。NKG2D与其配体的交联可触发NK细胞的细胞毒活性，在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用，靶细胞上NKG2D配体的表达水平几乎决定了机体NK细胞免疫应答的强弱。

之前本实验室利用噬菌体展示技术获得了以KDR胞外3区为抗原的单链抗体AK404R，但是考虑到单链抗体的相对较小的分子量(30KDa)并且缺失Fc片段，我们构建表达了一个融合抗体AK404R-MICA去增强其肿瘤治疗的有效性。

贝伐单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)是目前市场上最常用于针对VEGF-VEGFR2信号通路的抗体药物。是重组的人源化单克隆抗体，2004年获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。通过体内外检测系统证实IgGl抗体能与人血管内皮生长因子(VEGF)结合并阻断其生物活性。而阿瓦斯汀包含了人源抗体的结构区和可结合VEGF的鼠源单抗的互补决定区。

发明内容

发明目的

本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的融合抗体AK404R-MICA。本发明的融合抗体的特征是VEGFR2的单链抗体与MICA连接，在体外能够抑制人白血病细胞K562的增殖。

技术方案

一种VEGFR2的单链抗体与MICA连接融合抗体的制备，其特征在于：

VEGFR2的单链抗体与MICA连接的融合抗体包括以KDR胞外3区为抗原的单链抗体AK404R和MICA，通过一个Linker(G4S)连接。

一种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的抗体。

一种表达载体，含有上述的核酸。

一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。

一种毕赤酵母分泌表达法，用于分泌表达的融合抗体。

上述任一项的融合抗体或融合抗体片段的应用，选择性地与KDR3结合或NKG2D结合。

上述任一项的融合抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。

上述任一项的融合抗体或融合抗体片段的偶联物。

所述的偶联物，含有抗肿瘤药物、靶组成部分或报告组成部分。

发明进一步说明：

本发明中融合抗体基因序列全长1596个核苷酸，其中单链抗体735个核苷酸，MICA828个核苷酸，通过一个Linker(G₄S)连接。