[发明专利]一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法

权利要求书

1.一种通过同源重组技术生产转基因小鼠的方法，所述小鼠染色体中编码神经生长因子的基因被一个或多个拷贝的编码人神经生长因子的基因原位取代，所述方法包括如下步骤：

(1)构建含有人神经生长因子编码基因的同源重组载体，所述的同源重组载体依次包含5’-同源重组臂、FRT序列、嘌呤霉素抗性基因表达盒、FRT序列、鼠NGF信号肽序列、人NGF基因、鼠NGF3’-非翻译区序列、3’-同源重组臂；

(2)构建指导RNA模板DNA载体，所述载体含有在细胞内转录出RNA分子的两种DNA编码序列，所述DNA编码序列分别如SEQ ID NO:8和9的第320-329位核苷酸所示，所述RNA分子能够与小鼠染色体中编码神经生长因子成熟肽的DNA序列特异性互补，并被Cas-9DNA内切酶所识别并切割，造成小鼠NGF基因的断裂，启动小鼠细胞内的同源重组修复机制；

(3)构建含有Cas-9DNA内切酶基因的真核表达载体，所述载体含有与所述内切酶基因连接的编码入核信号肽的核苷酸序列，所述入核信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，在所述Cas-9DNA内切酶基因和所述编码入核信号肽的核苷酸序列之间有一个编码如SEQ ID NO:12所示的柔性多肽的核苷酸序列；

(4)将步骤(1)-(3)获得的3种载体一起转染入小鼠胚胎干细胞，并筛选发生了同源重组的细胞；

(5)将步骤(4)获得的胚胎干细胞显微注射入小鼠囊胚中，之后移植到假孕母鼠的子宫中，饲养受孕母鼠，获得受孕母鼠生产的子代小鼠，对所述子代小鼠进行基因鉴定，筛选出人NGF基因阳性的小鼠；

(6)在步骤(5)获得的人NGF基因阳性小鼠中，通过基因鉴定筛选嵌合率大于50％的成熟公鼠与未发生同源重组的原品系野生型小鼠进行交配，之后饲养受孕的母鼠，获得受孕母鼠生产的子代小鼠；

(7)使步骤(6)获得的子代小鼠之间进行交配，通过基因鉴定筛选出纯合子转基因小鼠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述嘌呤霉素抗性基因表达盒的表达受PGK启动子调控，所述载体还带有原核细胞的抗生素抗性基因，以便于在大肠杆菌中筛选阳性克隆。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体是在pBR322质粒基础上构建的，所述抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的转染为电转染或者脂质体转染。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)所述小鼠的品系为C57BL/6J。

6.一种通过转基因小鼠生产人NGF的方法，所述方法包括：

(1)饲养权利要求1-4中任一方法获得的转基因小鼠；

(2)从步骤(1)获得的小鼠的颌下腺中提取人NGF。