[发明专利]用于鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列及FISH鉴别方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞遗传学和分子生物学技术领域，具体涉及用于鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列及FISH鉴别方法。

背景技术

甘薯是旋花科甘薯属植物，富含淀粉、蛋白质、纤维素、β-胡萝卜素和多种维生素，被世界卫生组织列为13种最佳蔬菜的冠军。在亚、非、拉美等热带及亚热带地区广为栽培，是一种重要的粮食、蔬菜、工业原料作物及新型能源作物。近年来，甘薯在能源、健康食品、饲料等方面的价值越来越受到人们的重视，已经培育出了很多新型优良品种。

甘薯属植物染色体的基础研究薄弱，相对滞后于水稻、小麦等其他作物。甘薯属植物染色体有2×、4×、6×三种倍性，栽培种基本为6×。其染色体较小，数目较多，细胞质浓厚和染色能力弱，较难获得清晰干净的染色体制片，难以从细胞遗传学水平进行研究。目前的研究主要集中在染色体数目与减数分裂行为的观察，对甘薯多倍体的染色体组成和结构研究甚少。

显带技术和原位杂交技术(ISH)是研究染色体组成和结构比较重要的两种技术。显带技术主要是通过不同染色体的常异染色质的位置区分。原位杂交技术主要有基因组原位杂交技术(GISH)和荧光原位杂交技术(FISH)，GISH主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。FISH是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，通过荧光检测系统检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。

上述现有技术均可以有效区分染色体较大、较少或区分度比较明显的物种的不同对染色体，但对于染色体较小，且数目多，形态相近的甘薯物种，通过常规的显带、原位杂交等技术仍然不能很好的识别不同对染色体。同样，GISH的方法对于遗传背景十分复杂的甘薯物种也不能起到很好的识别效果。

发明内容

本发明的目的是提供用于鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列。

本发明的另一目的是提供一种以上述两个DNA重复序列为探针的荧光原位杂交方法，直观、简便、快速、有效地鉴别甘薯染色体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于鉴别甘薯染色体的DNA重复序列，序列Itf_1为SEQ NO：1所示的核苷酸序列，Itf_2为SEQ NO：2所示的核苷酸序列。

一种利用上述DNA重复序列鉴别甘薯染色体的荧光原位杂交方法，质粒DNA提取后，通过缺刻平移法，用生物素标记的Itf_1和用地高辛标记的Itf_2，形成核苷酸序列如SEQ NO：1所示的Itf_1探针和核苷酸序列如SEQ NO：2所示的Itf_2探针，用于对甘薯染色体的鉴别，具体步骤包括：

1)染色体片的制备

按常规植物材料培养，待植株根尖长至0.5-1cm时，切下生长旺盛的根尖，经8-羟基喹啉在25℃下处理2h后，用卡诺氏固定液固定24h；去离子水冲洗浸泡30min，充分洗去固定液；用含2％纤维素酶和1％果胶酶的纤维素果胶酶在37℃酶解1-2h；去离子水冲洗浸泡30min，充分洗去酶液；取1-2根尖于干净玻片上，用镊子尖端敲碎根尖，悬空滴加卡诺氏固定液使其充分散开，酒精灯上烤一下，晾干；镜检，选择分散良好的染色体片-20℃保存；

2)荧光原位杂交

①烤片：杂交之前，将制好的片子置于65℃烘箱中干燥30-60min；

②杂交液的配制：取ssDNA4μL和Itf_1，Itf_2探针DNA各3μL，混匀后于65℃烘箱中烘至4μL，再加入70％去离子甲酰胺10μL、50％硫酸葡聚糖4μL、20×SSC 2μL混匀，封口膜封好备用；

③变性液的配制：取双蒸水20μL、20×SSC10μL、70％去离子甲酰胺70μL，混匀，封口膜封好备用；

④探针变性：取出烘箱中的染色体片，将烘箱升温至85℃，将上述变性液加于取出的载玻片上，加上盖玻片；85℃烘箱中变性2-4min；甩掉盖玻片，立即依次浸入-20℃70％、95％、100％的冰乙醇中各5min；取出玻片，空气中干燥30min以上；

⑤杂交：将杂交液放入沸水中变性10min，迅速置于冰上冷却10min，加于上一步干燥后的载玻片上，盖上盖玻片，室温5-10min；置于80-85℃烘箱中变性2min，放入培养皿中，置于37℃培养箱中培养17-21h；