[发明专利]一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用。

背景技术

质粒作为应用最广泛的基因表达载体，可帮助外源基因转入受体细胞，并为其提供在受体细胞中的复制或整合能力及扩增与表达能力。质粒是细菌中一种独立于染色体之外的可自主复制的双链环状DNA分子，它含有独特的复制起始位点(ori)，有的还含有特定的复制子结构(replicon)，质粒的拷贝数与它的复制结构息息相关。

氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)含有多种膜结合脱氢酶，可不完全氧化醇、醛等化合物生成相应的醛、酮和酸，其独特的不完全氧化特性使得它具有广泛的工业应用价值。利用基因重组技术在氧化葡萄糖酸杆菌中过表达脱氢酶基因，可在很大程度上增加单位质量菌体的酶活，提高相关产物的合成效率。目前，广泛用于G.oxydans基因表达的质粒主要是广宿主质粒pBBR1MCS系列，但是该质粒拷贝数较低。近来，少数研究者报导了基于广宿主质粒pBBR1MCS或G.oxydans内源性质粒而改造的质粒。例如，Verena等人将编码G.oxydans核糖体蛋白L35和L13的基因的启动子区域整合到广宿主质粒pBBR1MCS-2中，构建了强启动子载体pBBR1p264和中等强度启动子载体pBBR1p452，有利于满足不同程度蛋白表达水平的要求(参见VerenaKallnik,Maria Meyer,UweDeppenmeier,Paul Schweiger.Construction of expression vectors for proteinproduction in Gluconobacteroxydans.Journal of Biotechnology,2010,150:460-465.)。本发明人曾以G.oxydans内源性质粒pGOX3为基础，构建了基因表达质粒pZL1。该质粒包含了pGOX3中与质粒分配有关的par基因和与复制有关的rep基因，以及质粒PUC19的氨苄抗性基因和复制起始区origin，因而该质粒在大肠杆菌及氧化葡萄糖酸杆菌中均可自主复制(参见Lin Zhang,Jinping Lin,Yushu Ma,Dongzhi Wei,Ming Sun.Construction of a Novel Shuttle Vector for Use in Gluconobacteroxydans.MolBiotechnol,2010,46:227-233.)。然而，这些质粒在G.oxydans中的拷贝数普遍较低，这大大限制了G.oxydans的工业应用潜能及科学研究进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用，从而解决现有技术中的质粒在氧化葡萄糖酸杆菌中的拷贝数普遍较低，导致氧化葡萄糖酸杆菌的工业应用受到限制的缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体，所述基因表达载体是：1)将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”序列得到的质粒(即将序列1689bp处的碱基T替换为碱基A得到的质粒)，或将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”序列得到的质粒(即将序列1707bp处碱基C替换为碱基T得到的质粒)，或以上两处均定点突变得到的质粒，其中，所述质粒pBBR1MCS-5序列如SEQ ID NO：1所示；或2)其他以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的碱基替换所得到的质粒。

本发明所提供的基因表达载体以广泛用于氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌构建的质粒pBBR1MCS-5或以pBBR1MCS质粒为基础的衍生质粒为骨架，将其与复制有关的rep基因启动子的-35区和-10区分别突变为保守序列“TTGACA”和“TATAAT”，从而增强该启动子的强度，以增加rep基因的表达量，进而提高质粒的拷贝数。

所述衍生质粒包括所有以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒。