[发明专利]尖吻蝮蛇血凝酶‑C

说明书

本发明是下述发明的分案申请：

申请日：2013年02月21日 ；申请号：201310055128.3；发明名称：尖吻蝮蛇血凝酶–C。

技术领域

本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶-C，本发明还涉及其分离纯化方法。

背景技术

据国内外文献的报导，在蝮亚科（Crotalinae）蛇毒中多存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”（thrombin-like enzyme, 简称：TLC）。类凝血酶与凝血酶（thrombin）的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。迄今已经发现现已在30多种蛇毒中含有类凝血酶成分，并有20余种得到分离纯化，其中有10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29～45kD之间，大多数为酸性糖蛋白。

在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其代表产品“立芷雪”（Reptilase）是由巴西矛头蝮蛇（Bothrops atrox）蛇毒中分离出的凝血酶，该酶前体由255个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，相对分子量39～43kD，为单链糖蛋白。翟宁等（上海医药工业研究院&浙江海正药业）2005年报道：从皖南五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。SDS－PAGE显示为单链，还原和非还原电泳分子量分别为59.25kD和52.58kD，显示存在链内二硫键，比活为41.5/u/mg，苯甲基磺酰氟（PMSF）可导致该酶不可逆失活。

近十多年来的研究发现在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键连接。Xin Cheng等（中国科技大学）1999年报导：从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，命名为“Agkisacutacin”。该蛋白由两条肽链构成，α-亚基分子量15kD，β-亚基分子量14kD。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的α链。肖昌华（中科院昆明动物研究所）2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到两种“类凝血酶”，均为双链分子结构。凝血酶Ⅰ的A亚基含有132个氨基酸，分子量16kD；B亚基含有123个氨基酸，分子量14kD，酶比活性为：160U/mg。凝血酶Ⅱ的A亚基含有122个氨基酸，分子量15kD；B亚基含有120个氨基酸，分子量13kD, 酶比活性为：70U/mg。该两种TLC经药理实验证明：均具有止血功效。唐松山2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。该酶由17kD和15kD两个亚基组成，等电点5.9。

本发明阐述从我国的广西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutu)蛇毒中分离得到一种新的蛇毒血凝酶――尖吻蝮蛇血凝酶-C。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶-C。

本发明的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。

本发明血凝酶-C是从中国尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）蛇毒中分离得到的血凝酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白含252个氨基酸，分子量为29213.4D，等电点pI为5.7。②由α、β两条链构成，链间由二硫键连接。③α链含129个氨基酸，分子量为14661.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；β链含123个氨基酸，分子量为14551.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟（PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。

本发明还提供上述血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤：

1）、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理；

2）、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE－Sephrose FF阴离子交换层析柱，用0.01M pH7.0～7.5的PBS洗柱，再用含0.02和0.06M NaCl的0.01M pH7.0～7.5的 PBS分段洗脱，收集0.06M NaCl第一个洗脱峰；

3）、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经多次稀释超滤去除NaCl；