[发明专利]单个靶实体的免疫化学检测

权利要求书

1.一种用于使样品中单个靶单位可视化的方法，其中所述靶被固定，包括

a)将含有单个靶单位的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与单个靶单位直接结合，

并且，用单个靶单位的部分亚群体形成一个或更多个离散的单个靶位点，其中每一单个的离散单个靶位点含有所述部分亚群体的一个单个靶单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

b)将a)的样品在水溶液(i)中孵育，所述水溶液(i)含有

范围为2mM至小于58.8mM的量的过氧化物化合物，

与a)的离散单个靶位点结合的所述酶的第一底物，以及，

所述酶的第二底物，

其中所述第一底物是水溶性富电子化合物，其

(3)能够与所述酶反应时产生自由基；并且

(4)能够在所述酶和过氧化物化合物存在时交联所述第二底物分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，

其中具有氧化还原酶活性的酶的所述第一底物是含有式(I)结构的化合物

式(I)：

其中，

R₁是芳基或乙烯基，

R₂、R₃和R₄独立地是-H、-N-(X)₂、-O-(X)₂，其中X是烷基、乙烯基或芳基，或-H，并且其中R₂、R₃和R₄不同时为-H，

其中，

H是氢；

O是氧，

其中，所述第二底物是偶联物分子，其含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自发光性、放射性或生色性物质以及特异性结合对的成员，

从而在a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并且使所述a)的单个靶位点可视化，

其中所述偶联物分子含有至少一种由式(II)定义的化合物作为具有氧化还原酶活性的酶的底物：

式(II)：

其中，

R₁是–H、–O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₂是–H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₃是–H、-OH、-NH₂或-SH，

R₄是-H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₅是–H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₆是-CON(X)₂或-CO-X，

其中，

H是氢，

O是氧，

S是硫，

N是氮，并且

X是-H、烷基或芳基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述发光性物质为荧光性物质。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有氧化还原酶活性的酶为过氧化物酶或酚氧化酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种结合剂是特异性结合对的成员。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述靶位点用样品中存在的少数单个靶单位形成。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述靶位点用样品中存在的多数单个靶单位形成。

7.根据权利要求1所述的方法，其中式(I)的化合物是3,3’-二氨基联苯胺或其衍生物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中式(I)的化合物是阿魏酸或其衍生物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中至少两种化合物由式(II)所定义。

10.根据权利要求9所述的方法，其中由式(II)所定义的至少两种化合物是相同的化合物。