[发明专利]一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法

权利要求书

1.一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取石斑鱼个体基因组DNA；

2)设计并合成一对石斑鱼类核基因RYR3的通用引物如下：

RYR3F15:5’-GGAACTATCGGTAAGCAGATGG-3’

RYR3R849:5’-GCCAGTGAAGAGCATCCAGAAGAAG-3’

3)以步骤1)所得的基因组DNA为模版，对RYR3基因进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小为797bp；

4)将步骤3)所得的PCR扩增产物直接测序，若所得序列无单核苷酸杂合位点，则直接判断该待测个体为纯种石斑鱼个体；

5)若步骤4)所得序列存在单核苷酸杂合位点，则进一步将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，链接至pMD19-T载体，转化E.coli DH5α进行克隆，挑取阳性克隆，PCR检测并测序，最终得到两个石斑鱼RYR3等位基因序列；

6)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤5)所得两条RYR3等位基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，若两条等位基因序列均与同种石斑鱼同源性最高，则待测个体仍为纯种石斑鱼；若两条等位基因序列分别与两个不同种类的石斑鱼有最高的同源性，则该待测石斑鱼个体为杂交个体；

7)为进一步确定杂交个体的双方亲本，以步骤1)所得的基因组DNA为模版，使用鱼类条形码COI基因通用引物进行PCR扩增，并将PCR产物直接测序，得到该杂交石斑鱼线粒体COI基因序列；

8)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤7)所得COI基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，与其同源性最高的种类即为该杂交石斑鱼的母本；

9)结合两条RYR3等位基因序列对应的两种石斑鱼，排除与母本相同的种类，另一个种类即为杂交石斑鱼的父本。

2.如权利要求1所述一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法，其特征在于在步骤3)、7)中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃变性5min，进入30个循环：94℃变性30s，55℃退火，30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。