[发明专利]一种检测土霉素的适体电极及其制备方法

权利要求书

1.一种检测土霉素的适体电极，其特征在于，由以下步骤制备而成：

1）石墨稀-金纳米纳米复合物层的制备；

（1）制备氧化石墨烯，

（2）合成石墨烯-金纳米纳米复合物：

玻碳电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；20μL 1.0 mg mL^-1氧化石墨烯滴加在已处理好的电极上，干燥；之后电极浸入 10 mL 含有2.8 mmolL^-1 HAuCl₄和0.1 molL^-1的H₂SO₄溶液，通过循环伏安一步电化学共还原，得到石墨烯-金纳米纳米复合物溶液；

2）环状探针的制备

（1）取3μL挂锁探针，9μＬ连接探针于已灭菌的100μL离心管内，加入6μLT４DNA连接酶缓冲溶液，50μL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；

（2）将此离心管放入95℃恒温10min，37℃恒温2h，使之杂交完全；

（3）加入2μL T4DNA连接酶，封口膜封口，16℃恒温2h，使挂锁探针连接完全后，65℃恒温20min使T4DNA连接酶变性；

（4）加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性，得环状探针；

3) 取玻碳电极，首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

后将电极浸入在10 μL 已经制备的石墨烯-金纳米纳米复合物溶液中，保持3 h；

待用二次水冲洗几次之后，10 μL，10μM的BSA-OTC耦合物溶液滴加在电极表面，室温下保持150 min，使BSA-OTC复合物完全固定在电极上；

室温下，所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，放入待检测土霉素的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h ；

加入10 μL 浓度为1μM一端带有OTC核酸适配体，孵育2 h；

用PBS冲洗，将游离的与OTC核酸适配体结合的目标物OTC洗去；放入制备好的10 μL浓度为30μM环状探针，再放入1μLdNTP，0.4μL 100*BSA，1μL Phi29DNA聚合酶，2μL Phi29DNA聚合酶buffer，在37℃下，孵育1.5 h；

加入10μL浓度为4 mM的亚甲基蓝，即得检测土霉素的电化学适体电极；

所述挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述连接探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述OTC核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的适体电极的制备方法，其特征在于，由以下方法制备而成：

1）石墨稀-金纳米纳米复合物层的制备；

（1）制备氧化石墨烯，

（2）合成石墨烯-金纳米（rGO-Au）纳米复合物：

玻碳电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；20μL 1.0 mg mL^-1氧化石墨烯滴加在已处理好的电极上，干燥；之后电极浸入 10 mL 含有2.8 mmolL^-1 HAuCl₄和0.1 molL^-1的H₂SO₄溶液，通过循环伏安一步电化学共还原，得到石墨烯-金纳米纳米复合物溶液；

2）环状探针的制备

（1）取3μL挂锁探针，9μＬ连接探针于已灭菌的100μL离心管内，加入6μLT４DNA连接酶缓冲溶液，50μL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；

（2）将此离心管放入95℃恒温10min，37℃恒温2h，使之杂交完全；

（3）加入2μL T4DNA连接酶，封口膜封口，16℃恒温2h，使挂锁探针连接完全后，65℃恒温20min使T4DNA连接酶变性；

（4）加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性，得环状探针；

3) 取玻碳电极，首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

后将电极浸入在10 μL 已经制备的石墨烯-金纳米纳米复合物溶液中，保持3 h；

待用二次水冲洗几次之后，10 μL，10μM的BSA-OTC耦合物溶液滴加在电极表面，室温下保持150 min，使BSA-OTC复合物完全固定在电极上；

室温下，所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，放入待检测土霉素的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h ；

加入10 μL 浓度为1μM一端带有OTC核酸适配体，孵育2 h；

用PBS冲洗，将游离的与OTC核酸适配体结合的目标物OTC洗去；放入制备好的10 μL浓度为30μM环状探针，再放入1μLdNTP，0.4μL 100*BSA，1μL Phi29DNA聚合酶，2μL Phi29DNA聚合酶buffer，在37℃下，孵育1.5 h；

加入10μL浓度为4 mM的亚甲基蓝，即得检测土霉素的电化学适体电极。