[发明专利]一种折叠引物及其PCR扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是一种折叠引物及其PCR扩增方法。

背景技术

二十多年前聚合酶链式反应(PCR，Mullis.k 1985)、耐热DNA聚合酶(Taq酶Saiki等1986)以及自动化热循环器(PCR仪——Thermo Cycler.PE Cetus公司1987)先后问世，PCR核酸扩增技术以其在数小时内选择性扩增感兴趣的基因(核酸)片段达百万倍(拷贝)的巨大潜力，直接推动了分子克隆、生物与遗传工程、核酸序列分析(DNA,RNA测序)等分子生物学技术和分子生物学研究飞跃发展，促进了从微生物到人类的基因组计划的实施和完成。仅数年间，世界各种生物实验室中，PCR核酸扩增技术迅速占据了统治地位。目前核酸扩增技术已成为几乎所有涉及生物的研究与应用领域(包括生物与遗传工程，临床与预防医学，农、林、牧、渔以及食品、药品等生物相关产业)的分子生物学关键技术。使用核酸扩增技术从各种样本中获取、检出感兴趣的核酸序列，为各种核酸(基因)的进一步分析提供快捷可靠而又经济的手段；特别是证实含有1个或多个突变(变异、缺失、插入)，或者遗传多态(单核苷酸多态，SNP)的靶核酸的存在，进而达到确认或鉴定生物种、株(型)直到辨认个体的目的。现在，核酸扩增—鉴定的高效性、灵敏性和可行性已经没有人怀疑了，核酸扩增—鉴定—测序—进一步分析已成为生命科学研究的重要模式和必经之路，核酸扩增正在成为所有生物相关学科和产业应用最广泛、最重要的实用技术。

聚合酶链式反应(PCR)是现有各种核酸扩增方法中效率最高、应用最广的基本核酸扩增方法。许多其他核酸扩增方法也是在其基础上发展起来。其基本原理是：是引物与目标(靶)核酸的互补退火与新生互补链的合成(延伸)：在适宜核酸合成的溶液(生化)环境中(含有必需的DNA聚合酶、至少一对寡核苷酸引物、靶DNA(模板)、Mg+、4dNIP以及适当且稳定pH的缓冲系统等)，在设定为核酸变性、退火和延伸3个温度循环变化的条件下，当温度上升到变性温度时模板靶DNA变性(解链)，降至退火温度时引物与互补的靶DNA结合退火，在延伸温度期间，通过DNA聚合酶催化作用，引物以靶DNA为模板，自其3端开始沿着5′—3′方向延伸，合成一条与靶DNA完全互补的新核苷酸链；第二个循环时，新合成的链作为反向引物的模板从另一个方向延伸，合成新链到前一个引物起始为止，从而限定了新链的设计长度，每个循环扩增产物以指数倍增，如此循环往复经过30个循环之后，完全同一的扩增产物可达到几十万到100万倍。可见引物的退火是核酸扩增反应中最关键的一步。