[发明专利]一对特异识别IκBα基因的多肽及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一对特异识别IκBα基因的多肽及其编码基因和应用。

背景技术

目前，人类同种器官移植面临供体器官稀缺的情况，而异种器官移植被认为是解决问题的有效途径。猪在解剖学、生理学和生化指标等方面与人极其相似，是人类异种移植供体来源的理想动物。异种器官移植通常会带来严重的免疫排斥反应，通过对猪基因进行修饰与改造，可以有效地减轻异种器官移植引起的免疫排斥反应。免疫排斥反应分为两种，一种是超急性免疫排斥反应，另一种是延缓性免疫排斥反应。核转录因子NF-κB(Nuclear factor-kappa B)在延缓性排斥反应中发挥着重要的作用。IκBα(Inhibitor kappa B alpha)，即核转录因子I-кB抑制因子α，是NF-κB的重要抑制因子。然而，IκBα可在炎性介质的刺激下被磷酸化而降解，从而导致NF-κB的激活。有报道称IκBα的突变体可有效抵抗磷酸化。所以对猪IκBα基因进行改造对研究延缓性排斥反应有着一定的意义。

寻找一种能靶向切割猪IκBα基因的技术相当重要。传统的打靶技术效率非常的低，其主要是依赖细胞内部的同源重组随机交换完成的，效率非常低。

近年来发展的主要方法为依托序列特异的核酸酶进行基因的精确修饰。序列特异的核酸酶主要由一个DNA识别域与一个能非特异性切割DNA的内切酶结构域连接而成。其主要原理为先由DNA识别域识别并结合到需要改造的DNA片段上，然后由与DNA相连的非特异性内切酶结构域对DNA进行切割，造成DNA的双链断裂(Double-strand break，DSB)，DSB会激活DNA的自我修复而引起基因的突变从而促进该位点的同源重组。

锌指核酸酶技术(Zinc Finger Nuclease，ZFN)就是前一段所述的基因精确修饰技术，由一个特异性的DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。在ZFN识别结构域中，一个锌指结构可以特异识别多个(通常是3个)连续的碱基，多个锌指结构能够识别一连串的碱基。所以，在ZFN的设计过程中，锌指识别结构域的氨基酸序列是重点，特别是设计如何将多个赖氨酸2-组氨酸2(Cys2-His2)锌指蛋白串联，以及如何通过改变α螺旋的16氨基酸残基决定每个锌指蛋白识别的特定三联体碱基。

ZFN技术在基因靶向修饰方面的可行性使得其广泛应用于个体水平和细胞水平的基因修饰。首先人们通过利用ZFN技术实现了细胞水平的基因定向修饰。如Sangamo公司于2005年首次在人类培养细胞系中实现ZFN介导的基因打靶，2007年应用同样的ZFN通过同源重组基因实现了基因定点插入。最近，人们利用ZFN分别在人的iPS和ES细胞中实现了基因的靶向突变。

相比之下，转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)有更多优势，它是继锌指核酸酶技术以来的另一种能够对基因组进行高效定点修饰的新技术。转录因子激活效应物家族中有一种蛋白(TALEs)能够识别、结合DNA。TALE与DNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34个恒定氨基酸序列介导。将TALEs与FokI核酸内切酶的切割域相连接，形成TALEN，从而可以实现对基因组DNA双链在特定位点进行修饰。

在TALE的中央存在着一个重复区域，这个区域通常是由33-35个氨基酸的数量可变的重复单元构成。重复序列结构域(Repeat Domain)负责识别特异性的DNA序列。每个重复序列基本上都是一样的，除了两个可变的氨基酸，即重复序列可变的双氨基酸残基(Repeat-Variable Diresidues,RVD)。TALE识别DNA的机制在于一个重复序列上的RVD能够识别DNA靶点上的一个核苷酸，再融合FokI核酸内切酶，组合成TALEN。TALEN是一种异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域)，能够切割两个相隔较近的序列，从而使得特异性增强。该酶的效率高，毒性小，制备周期短，成本低等优势越来越明显。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一对能够特异识别IκBα基因的多肽。

为实现上述目的，依托TALEN载体系统构建识别IκBα基因的多肽，本发明采用如下技术方案：