[发明专利]一种构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物领域，具体涉及一种构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的方法。

背景技术：

酵母双杂交系统利用了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域，DNA结合域(DNA binding domain，BD)及转录激活域(activation domain，AD)，将已知基因(诱饵基因)和靶基因或含有靶基因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上，当这两种质粒共同转化酵母感受态细胞，若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如Ade、His及Lac等的表达，从而在特定的缺陷培养基上生长。因此，利用酵母双杂交系统能够筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，还可以研究己知蛋白间的相互作用。

其中酵母双杂交cDNA文库的构建一般在cDNA两端加上同源重组序列，然后与靶蛋白载体如pGADT7-Rec共同转化靶蛋白酵母菌株如AH109，在酵母同源重组酶的作用下，cDNA序列整合到载体上，完成cDNA文库的构建。由于绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，所以提取真核生物的总RNA后可通过使用带有Oligo(dT)的同源重组序列与其配对，仅mRNA可被反转录，同时反转录得到的cDNA已加上同源重组序列。

但是细菌的mRNA绝大部分不带有Poly(A)尾，并且mRNA仅占总RNA的1-4％，若使用随机六聚体作为引物，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，合成的cDNA中96％来源于rRNA，成分过于复杂。现有的针对细菌文库的构建一般是通过使用限制性内切酶对细菌基因组DNA进行不完全酶切，然后与文库载体连接后转化大肠杆菌，无法避免内切酶对位点的偏向性，大大降低文库的丰度，因此细菌的cDNA文库的构建及筛选一直被限制。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能高质量构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的方法。

本发明的酵母双杂交cDNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取细菌总RNA，再去除总RNA中的5s rRNA、tRNA及小分子RNA，再对mRNA进行富集，使用随机六聚体作为引物对富集的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)合成单链的cDNA，再通过LD-PCR以单链的cDNA为模板扩增获得双链cDNA，再利用同源重组将全长双链cDNA与文库载体共同转化靶蛋白酵母菌株，获得细菌的cDNA文库。

优选，所述的去除总RNA中的5s rRNA、tRNA及小分子RNA是利用试剂盒MEGAclear^TMKit去除的。

优选，所述的对mRNA进行富集是利用试剂盒MICROB ExpressTM Bacterial mRNAEnrichment Kit(Ambion)对mRNA进行富集。

优选，所述的酵母菌株为酵母菌株AH109。

与已有方法相比，本发明提出了一种以细菌mRNA作为模板，反转录合成cDNA后构建酵母双杂交cDNA文库的方法。由于是以mRNA为模板，不仅避免了以总RNA反转录时rRNA产生干扰，也可以避免使用限制性内切酶对细菌基因组DNA的位点偏向性，文库的开放性阅读框的正确性更高，质量非常好。

附图说明：

图1是细菌总RNA的电泳检测图；

图2是去除5s rRNA、tRNA及小分子RNA的RNA样品的电泳检测图；

图3是富集的mRNA的电泳检测图；

图4是扩增获得的双链cDNA的电泳检测图；

图5是用BD CHROMA SPIN TE-400滤柱纯化回收双链cDNA的电泳检测图；

图6是酵母双杂交菌株Y2HGOLD的SD/-Leu平板涂布生长图；

图7是cDNA文库质量检测的电泳检测图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：细菌总RNA的提取