[发明专利]山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物及其鉴定方法。

(二)背景技术

山稻在我国具有悠久的栽培历史，分布广泛，尤以云南、贵州等少数民族聚居地为多，主要采用游耕性质的刀耕火种生产方式。长期的自然选择和人工培育，形成了我国丰富的山稻种质资源。近年来，随着林下经济的发展，建设各种规模大、效益好、带动力强的林下经济发展模式，已成为国家对发展林下经济所要实现的主要目标。然而长期以来，中国山稻主产地的山稻生产、销售一直较为混乱，“异种同名、同种异名”现象普遍存在，特别是一些优良品种频繁被假冒而出现在山稻种质资源市场上，极大地损害了山稻育种者和生产者的利益。因而对于山稻品种，建立一种简便、快速、可靠的优良品种鉴定技术尤为迫切。

分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌种鉴定技术提供了有效手段。一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)在上个世纪90年代已用于各类物种的分类鉴定上，但这些标记用于山稻品种的鉴定均不够理想。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region，特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。

(三)发明内容

本发明目的是提供山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物，以及一种能对山稻百灵谷14号进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3′，

下游引物：5′-GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得山稻百灵谷14号的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该特异性引物对山稻品种进行PCR扩增，仅山稻百灵谷14号可获得903bp的特异性片段，其他山稻品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于山稻品种的鉴定(鉴定其是否为山稻百灵谷14号)，即待测样品仅限于山稻。

本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对山稻百灵谷14号进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测山稻品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现903bp的特异DNA条带，则待测山稻品种为山稻百灵谷14号，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3′，

下游引物：5′-GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3′。

本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR扩增体系组成如下：

余量为ddH₂O；

PCR扩增条件如下：

先94℃预变性6min；

92℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸2min，共30个循环；

最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR Buffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH 8.5)、500mM KCl、25mM MgCl₂和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

具体的，所述方法如下：

(1)取待测山稻叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测山稻叶片的基因组DNA；