[发明专利]修剪式多位点组合装配

权利要求书

1.一种产生多个修饰的多核苷酸的方法，其包括：

(a)在单一反应混合物中将至少三种引物添加至双链模板多核苷酸，其中所述至少三种引物不重叠，并且其中所述至少三种引物的每一种包括至少一个不同于其他引物的突变，其中至少一种引物是可与所述模板的负链退火的正向引物以及至少一种引物是可与所述模板的正链退火的反向引物，和

(b)使所述反应混合物进行聚合酶延伸反应以从所述至少三种引物产生多个延伸的修饰的多核苷酸。

2.权利要求1的方法，其在步骤(b)之前进一步包括：

根据它们在所述模板多核苷酸上的位置，将所述引物编成多个组，其中覆盖所述模板上的相同选择区域的引物在一个组中，

将每组中分入的引物归一化至相等的浓度，

将一组中的所述正向引物富集成正向组并将每一正向引物组之间的浓度归一化至相等，

将一组中的所述反向引物富集成反向组并将每一反向引物组之间的浓度归一化至相等，和

将相等量的所富集的正向和反向引物添加至所述反应。

3.权利要求1的方法，其进一步包括用未经连接酶处理的所述多个延伸的产物转化细胞。

4.权利要求3的方法，其进一步包括从所述细胞回收所述多个延伸的修饰的多核苷酸。

5.权利要求4的方法，其进一步包括分析所述多个延伸的修饰的多核苷酸。

6.权利要求5的方法，其中分析包括表达所述多个延伸的修饰的多核苷酸中的至少一个并分析由其表达的多肽。

7.权利要求6的方法，其进一步包括选择包括感兴趣的突变的所述多个延伸的修饰的多核苷酸。

8.权利要求1的方法，其进一步包括分析由所述聚合酶延伸产生的所述多个延伸的修饰的多核苷酸。

9.权利要求1的方法，其进一步包括用酶处理所述多个延伸的修饰的多核苷酸，从而破坏所述模板多核苷酸，将经处理的延伸的修饰的多核苷酸转化入细胞，从所述细胞回收所述多个延伸的修饰的多核苷酸，并选择包括感兴趣的突变的所述多个延伸的修饰的多核苷酸。

10.产生包括感兴趣的突变的多个修饰的多核苷酸的方法，其包括：

(a)在单一反应混合物中将至少两种引物添加至双链模板多核苷酸，其中所述至少两种引物不重叠，并且其中所述至少两种引物的每一种包括至少一个不同于其他引物的突变，其中至少一种引物是可与所述模板的负链退火的正向引物以及至少一种引物是可所述模板的正链退火的反向引物，

(b)使所述反应混合物进行聚合酶延伸反应以从所述至少两种引物产生多个延伸的修饰的多核苷酸，

(c)用酶处理所述多个延伸的修饰的多核苷酸，从而破坏所述模板多核苷酸，

(d)将所述处理的延伸的修饰的多核苷酸转化入细胞，所述多核苷酸未用连接酶处理，

(e)从所述细胞回收所述多个延伸的修饰的多核苷酸，以及

(f)选择包括感兴趣的突变的所述多个延伸的修饰的多核苷酸。