[发明专利]一种功能化磁珠分离‑酶联适配体检测食品中土霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品中土霉素的检测方法，属于食品安全分析技术领域。

背景技术

土霉素(Oxytetracycline，OTC)，别名5-羟基四环素，地霉素，地灵霉素，氧四环素等，是一种广谱抗菌药物，常作为牛、猪、家禽、鱼等动物疾病的预防和感染的治疗用药。然而由于滥用及不遵守休药期规定等原因，造成其在畜产品中的残留，不仅给人类健康带来严重危害，也给环境造成了严重威胁。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对食品中土霉素的残留限量作了规定。

目前，土霉素检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。但仪器分析方法设备昂贵，前处理繁琐。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，但由于受到抗体易失活、制备依赖免疫动物和细胞、繁琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在一定程度上限制了抗体在快速检测技术中的应用。

核酸适配体（Aptamer）技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足。目前已有利用核酸适配子为识别分子应用于食品中土霉素检测的报道。如刘宾（暨南大学硕士论文）建立了基于配适体的生物素-亲和素酶联检测土霉素的分析方法，但检测限（1.5g/L）不能满足土霉素检测的需要（限量值：100mg/kg）。Kim et al.（Anal. Chim. Acta, 2009, 634: 250-254）建立了适配体电化学传感器检测土霉素的分析方法，但适配体固定步骤相对耗时，且样品基质对电化学信号易造成干扰。2010年他又利用纳米金修饰的适配体为探针比色检测土霉素（Biosens. Bioelectron 26: 1644-1649），但无法精确定量。2014年Kim et al. （Biosens. Bioelectron 51: 426–430）基于ELISA原理，建立了牛奶中土霉素的间接酶联适配体分析（ic-ELAA）方法，检测限为12.3 ng/mL，但方法需要将OTC–BSA包被于酶标板，造成检测时间较长（>10h）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、检测快速、灵敏度高、成本低的功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，采用核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针，通过HRP-OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。

其原理是将适配体通过生物素-亲和素系统固定于纳米磁珠表面，辣根过氧化酶酶标记OTC（HRP-OTC）与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，通过底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。检测原理如图1所示。

核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备，采用文献（Wu SJ, Duan N, Wang ZP, et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314）报道的方法进行制备。

进一步的，所述的核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针为生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠，即采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米颗粒，然后利用戊二醛法将氨基化的纳米磁珠与亲和素偶联。

进一步优选，所述OTC核酸适配体的5’端修饰了生物素，通过生物素-亲和素系统，同时固定于亲和素修饰的纳米磁珠表面。

作为优选方案，上述的功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，包括如下步骤：

1）HRP-OTC与OTC直接竞争结合固定于纳米磁珠表面的OTC适配体：

a.将步骤1）中制得的纳米磁珠分散于PBS中，取100μL添加到酶标板孔中，磁分离，去上清；

b.每孔中加入200µL封闭液，37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤多余的封闭液；

c.然后于每孔中依次加入50μL HRP-OTC和50μLOTC标准品溶液，37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤液洗涤；

d.每孔中加入100μL TMB底物显色液，37℃避光反应20min；

e.最后每孔中加入100μL 终止液终止反应，酶标仪450nm 测吸光值；

2）标准曲线的绘制