[发明专利]一种油菜抗菌肽BnLTP1及其应用

权利要求书

1.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的蛋白质对应的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求2所述的基因，其序列为SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的基因在制备抗菌药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗核盘菌药物、抗灰霉菌药物、抗稻瘟病菌药物、抗大肠杆菌药物、抗藤黄八叠球菌药物或抗毕赤酵母药物。

7.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的基因在增强植物对腐生营养型真菌抗性用的应用，所述的真菌为核盘菌、灰霉菌或稻瘟病菌。

8.权利要求1所述蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）融合表达载体EDDIE-BnLTP1的构建

利用30abackbone-F: TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和30abackbone-R: GCAGCTGGTCACCCACAGCG引物，通过反向PCR扩增，将pET30a/His-EDDIE-GFP载体线性化；将回收到的pET30a/His-EDDIE-GFP线性化载体片段与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，同时转化大肠杆菌XL10-Gold菌株，通过体内定点同源重组，将BnLTP1基因连接到表达载体pET30a/His-EDDIE-GFP上，获得目的基因融合表达载体EDDIE-BnLTP1；

2）抗菌肽BnLTP1体外诱导表达与分离纯化

将测序正确融合表达载体EDDIE-BnLTP1质粒，用热激法转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得EDDIE-BnLTP1融合表达工程菌BL21(DE3)/pETNB；利用常规方式在LB液体培养基中培养并诱导蛋白表达，获得的菌体破碎离心，上清纯化后，即得目的蛋白抗菌肽BnLTP1，其序列为SEQ ID NO.2所示。

9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的基因在制备同时抑制藤黄八叠球菌，大肠杆菌，酵母菌，核盘菌，灰霉菌及稻瘟病菌药物中的应用。

10.利用overlap PCR方法合成权利要求3所述基因序列的引物：

BnPEV53256_1：CGCTGTGGGTGACCAGCTGCGGCGCTGACCTGCGGCACCGTGAACAGC；

BnPEV53256_2：CCCCCCTGGGTAATATAGCCAATGCACGGCGCCACATTGCTGTTCACGGTGCCG；

BnPEV53256_3：GGCTATATTACCCAGGGGGGACCGCTGCCCGGAGCGTGCTGCACCGGCTAAAGC；

BnPEV53256_4：GGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGCTATTCAGTTTGCTTTAGCCGGTGCAGC；

backboneF：TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC；

backboneR：GCAGCTGGTCACCCACAGCG。