[发明专利]一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法

权利要求书

1.一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)银杏叶片经24小时以上暗处理，耗尽淀粉粒；

(2)将叶片冰浴下用研钵碾碎，加入提取缓冲液研磨成浆后4层纱布过滤，取滤液，所述提取缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl₂，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA，0.04％巯基乙醇，0.1％PVP；

(3)滤液于4℃，1500g离心10min进行沉积得叶绿体沉淀颗粒，并用分离缓冲液悬浮，所述分离缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl₂，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA；

(4)Percoll密度梯度液制备：用分离缓冲液分别配制40％和80％Percoll，由上至下分别加入5ml的40％Percol和2.5ml的80％Percoll，形成Percoll密度梯度液；

(5)将悬浮的叶绿体颗粒1ml加入到制好的Percoll密度梯度液的顶端，经4℃，6000g离心30min后，在80％和40％Percoll细胞分离液之间的分界面上收集完整叶绿体，并用分离缓冲液清洗两次，分离得到完整的叶绿体颗粒；

(6)将蛋白质提取缓冲液加入到所提取的叶绿体颗粒中,室温下漩涡混匀5min，加入等体积的Tris-平衡酚(pH 8.0)，超声波混匀10min；所述蛋白质提取缓冲液成分为：100mMTris,100mM EDTA,50mM硼砂,50mM维生素C，1％Triton X-100,2％巯基乙醇，30％蔗糖；

(7)混合液经4℃，15000g离心15min后，将上层的酚相转移到新离心管中；

(8)酚相中加入5倍体积的0.1M醋酸銨溶液，放入-20℃条件下6小时以上以沉淀蛋白，后经4℃，15000g离心15min得蛋白质颗粒；

(9)蛋白质颗粒重新悬浮，用冰冻的甲醇和丙酮各清洗两次，每次清洗均经4℃，15000g离心5min，仔细倒出上清液留沉淀即为高纯度的叶绿体蛋白质；清洗好的蛋白质颗粒空气中干燥待用。

2.根据权利要求1所述的银杏叶片叶绿体蛋白质提取方法，其特征在于步骤(1)-(5)的所有操作需在0-4℃下进行。