[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物病毒领域，更具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒的培养方法。

背景技术

猪流行性腹泻病毒严重影响了我国的养猪业，其感染性强、危害性大，是影响全球养猪业的最重要病毒之一，哺乳仔猪感染后死亡率可达100％，母猪常以带毒而不表现症状形式出现。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属的1群，传染性胃肠炎，猫冠状病毒、犬冠状病毒与其属于同一冠状病毒属(Utiger等，1995a)。猪流行性腹泻病毒最初在20世纪70年代被发现，首次发现的病毒经分离纯化及传代后的病毒被命名为CV777，至今很多疫苗生产单位仍然在使用该毒株作为疫苗毒株使用。最近几年在临床上爆发了严重的哺乳仔猪腹泻，且死亡率极高，因此各研究机构都在对引起该疾病的病原进行分析。调查结果显示，引起哺乳仔猪腹泻并死亡的主要病原为猪流行性腹泻病毒，通过对现流行毒株的基因分析，发现流行毒株与二十世纪70年代分离到的CV777毒力基因发生了较大的改变，所以这也许是用含有原始毒株的疫苗免疫失败的原因之一。

目前，各个研究机构对临床分离的猪流行性腹泻病毒进行了体外细胞感染，试图通过体外培养来使该病毒增殖以期用于目前的猪流行性腹泻的防控。国内外有多篇文献报道指出，临床分离到的猪流行性腹泻病毒可以用多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、BHK细胞等，但临床新分离的猪流行性腹泻病毒野毒株很难培养，并且培养后基本测不到半数组织细胞感染量(TCID50)，这给该病毒扩大生产及病毒量确定造成了巨大难题，所以如何提高病毒对细胞的浸染效率使之适应体外规模化培养是该病毒体外培养的难点所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种猪流行性腹泻病毒的培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的培养方法，包括以下步骤：

(1)DMEM培养基的配制：将13.4克DMEM干粉溶于一升的去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH值至6.8-7.8，并用≤0.22μm的无菌滤膜进行除菌过滤，置于≤4℃的冰箱待用；

(2)在上述配制好的DMEM培养基中加入占DMEM培养基体积1-8％的胎牛血清，并将该DMEM培养基置于培养容器内进行单层细胞的培养；

(3)将形成有单层细胞的培养容器内的DMEM培养基弃去，并用洗液洗涤2-3次；

(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和步骤(1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0.1-0.5％，细胞亲和剂用量为DMEM培养基体积用量的0.01-1％；

(5)将步骤(4)中加入猪胰蛋白酶和细胞亲和剂的DMEM培养基放置细胞培养箱中静置培养1分钟-30分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，步骤(2)中所述的单层细胞为Vero单层细胞、293单层细胞、ST单层细胞、BHK单层细胞中的任意一种。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，步骤(3)中所述的洗液为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液中的任意一种。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，在步骤(4)中所述的细胞亲和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，在步骤(4)中所述的细胞亲和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.1-1％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-0.8％。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.2-0.8％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.3-0.5％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.25-0.5％。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述细胞亲和剂的制备方法如下，按照质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各组分溶于去离子水中，过滤即得。