[发明专利]一种猪瘟疫苗感染性cDNA及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及利用反向遗传操作获得一种猪瘟 弱毒疫苗C株感染性cDNA克隆，同时涉及该感染性cDNA克隆在构建高效价重 组猪瘟活疫苗和猪瘟疫苗载体中的应用。

背景技术

猪瘟是猪的一种传染性极强的病毒性疾病，早期称为猪霍乱(Hog Cholera， HC)，可感染各种年龄猪，一年四季流行，发病率和死亡率均很高，危害巨大。 猪瘟的病原体是猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，在国际兽疫 局(OIE)制定的《国际动物卫生法典》中，猪瘟被列入A类16种法定报告的传 染病之一。我国近年来猪瘟频发，给养猪业造成严重经济损失，妨碍了养猪业 的发展和出口贸易。加强对猪瘟的有效防控，是促进养猪业健康发展、提高养 殖效益和让国民吃上放心肉的必然要求；发展高效的猪瘟控制技术和疫苗制品, 提升猪瘟防控水平是科技工作的重大课题。

CSFV基因组为长约12.3kb的单股正链RNA，由5'末端非编码区(5' Untranstaled region，5'UTR)、一个大的开放阅读框架(ORF)和3'末端非编码 区(3'UTR)构成。ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，多聚蛋白 在翻译过程中或翻译后，被病毒自身编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白酶加工成 12种成熟蛋白质，包括4种结构蛋白C、E^rns、E1、E2和8种非结构蛋白N^pro、P7、 NS2、NS3、NS4A、S4B、NS5A和NS5B。其中，E^rns、E1和E2嵌入脂质双层膜中， 在病毒粒子表面形成突触，介导病毒的吸附与入侵，是CSFV毒力相关因子和保 护性抗原蛋白。E2常以同源二聚体或ElE2异源二聚体存在于病毒粒子和宿主细

猪瘟疫苗接种是预防和控制猪瘟的最有效方法。早在1951年，我国研究人 员筛选出免疫原性优良的CSFV石门毒株(殷震，1997)，该毒株作为中国CSFV 标准强毒株沿用至今。当时使用CSFV石门毒株，灭活制成猪瘟结晶紫甘油灭活 疫苗，使用后迅速控制了我国的猪瘟疫情。1954-1956年间，中国兽药监察所等 单位的研究人员将CSFV强毒株(其中包括标准强毒石门株)适应家兔，在兔体内 连续传代，选育出一株对猪基本无毒力，并保持CSFV免疫原性的兔化毒株，即 中国猪瘟兔化弱毒疫苗株(hog cholera lapinized vaccine，HCLV)，简称猪瘟 疫苗C株。猪瘟兔化弱毒疫苗的成功研制和应用，对我国猪瘟的预防和控制起 了决定性作用。然而，猪瘟兔化弱毒疫苗60年来的广泛使用，并未控制猪瘟的 发生。尽管疫苗的接种剂量和免疫次数增加，不仅没有根除猪瘟，近年来，我 国猪瘟的发生出现了许多新特点，表现为从频发的大流行转变为无规律的散发 流行；临床症状从典型变为非典型猪瘟，病毒毒力降低，病程由急性、亚急性 转变为以慢性为主，出现持续感染、胎盘感染、母猪繁殖障碍以及新生仔猪的 先天性感染等。猪瘟疫苗株在细胞中增殖滴度不高、制备高效价疫苗困难是导 致疫苗保护效力低下和猪瘟防控困难的重要原因之一。猪瘟的发生、传播和流 行是严重制约我国养猪业健康发展、增加农民收入和发展国际贸易的瓶颈。

为满足我国预防、控制和最终根除猪瘟的需要，研制新一代高效价猪瘟疫 苗制品，提高猪瘟疫苗免疫保护效力，势在必行。此外，提高猪瘟疫苗细胞生 长滴度也是降低疫苗生产企业生产成本、提高疫苗质量和效益的根本保证。

另一方面，CSFV感染引起猪体的免疫抑制，感染CSFV的猪体更容易发生圆 环病毒、猪繁殖和呼吸综合症病毒、乙型脑炎病毒等的混合感染，导致猪死亡 率更高，危害更加巨大。基于猪瘟活疫苗载体表达其他病原保护性抗原蛋白构 建双价疫苗，能同时防控猪瘟及相关猪病，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种猪瘟疫苗的全长感染性cDNA,该全长感染性 cDNA包含了猪瘟疫苗种毒全长cDNA、在该cDNA 5′末端融合猪RNA聚合酶I 启动子，在cDNA 3′插入鼠RNA聚合酶I终止子；

进一步的，本发明提供猪瘟疫苗C株的全长感染性cDNA,该全长感染性cDNA 包含了猪瘟疫苗C株全长cDNA、在该cDNA 5′末端融合猪RNA聚合酶I启动 子(GenBank No.L31782.1)，其序列为SEQ ID NO：1；在cDNA 3′插入鼠RNA 聚合酶I终止子，其序列为SEQ ID NO：2；

为实现上述目的，本发明提供一种构建上述猪瘟疫苗C株的全长感染性cDNA 克隆的方法，包括：