[发明专利]一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明公开一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法，步骤包括禽流感工作种子批毒种的建立；病毒接种与培养；病毒灭活；病毒收获液过滤与浓缩；病毒纯化；去糖；配制成H7N9禽流感病毒灭活疫苗的半成品。依据本发明方法制备的H7N9型重组流感灭活疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

技术领域

本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法。

背景技术

流感是流行性感冒的简称，是由流感病毒引起的人兽共患传染性疾病，人感染后主要表现症状为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高；2013年4月以来发生的H7N9亚型流感，已对人、禽造成巨大威胁。目前，主要采用疫苗进行预防，所用疫苗包括病毒灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗等。

流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一型为血细胞凝集素(即H)，一型为神经氨酸酶(即N)，H又分16个亚型，N分9个亚型。此次新出现的H7N9亚型流感属于禽源由HA7和NA9与H9N2亚型6个内部片段重组形成。对人禽均有巨大威胁。

在针对禽流感H7N9病毒的疫苗研究方面，现有技术中尚未见良好疗效的针对H7N9亚型的粘膜免疫疫苗，更未有良好疗效的针对H7N9亚型病毒的多表位粘膜免疫疫苗，面对可能的禽流感H7N9病毒感染的流行，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防禽流感。

发明内容

针对背景技术所存在的技术问题，本发明目的在于提供一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法，该方法制备得到的疫苗能预防H7N9亚型禽流感病毒的感染。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)禽流感工作种子批毒种的建立：将来自于A/Anhui/01/2013的H7N9亚型禽流感病毒株HA、NA序列合成后，通过反向遗传技术救获H7N9/PR8重组流感病毒，检测其遗传稳定性，接种10日龄的SPF鸡胚，建立H7N9亚型禽流感疫苗主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；

(2)病毒接种与培养：于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔接种稀释为10^-4-10^-7稀释度的H7N9重组禽流感工作种子批毒种，每胚0.1ml；将鸡胚置35-37℃培养40-72小时；挑选活胚置4℃冷胚15-20小时，收获病毒尿囊液；

(3)病毒灭活：将获得的病毒尿囊液中加入0.1％甲醛在37℃下灭活36-72小时，并将灭活毒在10日龄的SPF鸡胚中盲传3代，检测鸡胚尿囊液HI检测均为阴性为灭活合格；

(4)病毒收获液过滤与浓缩：将灭活后的尿囊液进行过滤，即经10um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为500K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/L的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/LPB回收病毒液；

(5)病毒纯化：蔗糖速率区带离心：分别用30％和60％蔗糖作为蔗糖密度梯度，以100000g/min的速度离心4小时；

(6)去糖，用相对分子质量为300K的超滤膜进行过滤、去糖，加入0.01mol/L PBS回收病毒液；

(7)半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素HA蛋白含量为120ug/ml(总蛋白浓度约360ug/ml)，再加入2.4mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于20-25℃搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒灭活疫苗的半成品。