[发明专利]舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种亚洲型舞毒蛾的细胞色素P450基因 CYP6AN15v1dsRNA及其在防治亚洲型舞毒蛾中的应用。

背景技术

据国外报道舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）可危害300多种植物，国内报道可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500余种植物。舞毒蛾传播快，繁殖量和取食量大，给林业生产造成重大经济损失。目前对亚洲型舞毒蛾的防治，仍然是以化学杀虫剂为主，虽然防效显著，但这些化合物容易引起“3R”问题不容忽视。尽管一些害虫天敌、致病微生物等生物防治手段在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但这些防治技术存在受外界环境影响大、见效慢、效果不明显等弊病，严重制约了舞毒蛾防治的发展。随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi技术控制害虫的危害已成为植物保护工作者研究的重点和热点。RNAi技术因具有高效、特异性等特点，在农业生物技术领域展示出了很大的潜力，并且作为一种新的方法来防治农林业害虫。迄今，RNAi技术已经在农业害虫防治中得到应用。一方面是通过导入功能基因dsRNA来实现RNAi，当有害生物取食转基因植物时，引发害虫体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的取食能力；例如，张维等（2013）将棉蚜的V-ATPase-A基因转入到拟南芥中并饲喂烟草天蛾幼虫具有致死效应；李晓明等（2010）通过转基因烟草对棉蚜有一定的防控效果；Mao等（2007）研究发现棉铃虫取食含有表达CYP6AE14的dsRNA转基因棉花后，棉铃虫的P450基因表达量明显降低，害虫的食欲降低，生长发育迟缓，最后死亡。另一方面，通过筛选具有致死效应的siRNA（一般来源于生物体内参与重要生物化学途径的候选基因），通过化学方法合成，可应用于新型的杀虫剂生物农药。鉴于RNAi技术具有高效性和特异性，对人畜和非靶标生物安全、无害虫抗药性等特点，缓解了化学农药长期施用导致“3R”这一难题。因此，RNAi技术将为害虫防治开辟了新的途径。在昆虫中，细胞色素P450的功能主要与抗药性相关，主要参与代谢杀虫剂或来自植物的次生物质，其对杀虫剂的代谢是昆虫产生抗药性的重要机制之一。

目前，有关通过抑制细胞色素P450 CYP6AN15v1基因转录水平来防治林木重要害虫舞毒蛾及提高其对有机磷类农药氧化乐果的敏感性未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用，利用分子生物学手段干扰舞毒蛾重要的解毒酶基因CYP6AN15v1，降低了昆虫的生存能力，甚至死亡，同时还提高了对有机磷类杀虫剂的敏感性。舞毒蛾细胞色素P450 CYP6AN15v1基因沉默后，显著影响舞毒蛾幼虫的生长发育和生理代谢，同时有机磷类杀虫剂的敏感性提高，对防治无公害舞毒蛾提供了新思路和新材料。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术措施，如无特殊说明，本发明所采用的技术方法，均为本领域中常用的方法。

一种亚洲型舞毒蛾细胞色素P450 CYP6AN15v1基因，其核酸序列如SEQ ID No.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，获得方法如下：

根据NCBI数据库中检索舞毒蛾CYP6AN15v1（登陆号为KF853201.1）的细胞色素P450序列，设计编码区设计上游引物Ld CYP6AN15v1F:5’ ATGTTCGCTCTATTACTACTGTTTCTACTACTATTAG 3’； Ld CYP6AN15v1R: 5’ TTTCCTCAGCTTCAGTCTAACAGGTAGACC3’，通过RT-PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所示序列。

本发明以亚洲型舞毒蛾CYP6AN15v1基因片段为模板，并设计特异的dsRNA引物对，通过MEGAscript RNAi试剂盒（Ambion）合成CYP6AN15v1基因dsRNA，dsRNA序列如SEQ ID NO.3所示。

上述CYP6AN15v1基因dsRNA在无公害防治中的应用，主要表现在以下两方面：