[发明专利]舞毒蛾CYP6B53基因dsRNA及其在无公害防治中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及亚洲型舞毒蛾的细胞色素P450 CYP6B53基因dsRNA及其在防治亚洲型舞毒蛾中的应用。

背景技术

舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）是世界性的害虫，分布广，食性杂，据国外报道可危害300多种植物，国内报道可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500余种植物。舞毒蛾传播快、繁殖量和取食量大，给林业生产造成重大经济损失，目前对亚洲型舞毒蛾的防治，仍然是以化学杀虫剂为主，但这些化合物容易引起害虫抗药性的形成和环境污染问题。尽管一些害虫天敌、致病微生物等生物防治在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但这些防治技术存在天敌饲养难、受气候环境影响大、见效慢、效果不明显等弊病，严重制约了舞毒蛾防治的发展。然而，随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi技术控制害虫的危害已成为植物保护工作者研究的重点和热点。Napoli（1990）首次发现RNAi现象，将外源基因引入矮牵牛内引起内源基因的沉默，当时把这种现象称为“共抑制”。1998年，华盛顿Carnegine研究所的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症研究中心的Craig C. Mello阐述了基因沉默现象的本质，并定义了RNAi。由于RNAi具有高特异性的沉默技术，因而展示出了很大的潜力，并且作为一种新的方法来防治农业害虫，已在农业害虫防治中得到应用。一方面通过基因工程手段将害虫靶标基因dsRNA转入植物体内，当有害生物取食转基因植物时，引发害虫体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的取食能力，例如：Baum等（2007）通过转基因玉米防治玉米根部害虫玉米根叶甲Diabrotica virgifera饲喂表达ATP酶dsRNA的转基因植物，导致玉米根叶甲发育迟缓和死亡率升高；Mao等（2007）研究发现棉铃虫（Helicoverpa armigera）取食表达CYP6AE14的dsRNA转基因棉花后，棉铃虫的P450基因表达量明显降低，害虫的食欲降低，生长发育迟缓，最后死亡。另一方面，通过筛选具有致死效应的siRNA（一般来源于生物体内参与重要生物化学途径的候选基因），并用化学方法合成，可应用于新型的杀虫剂生物农药。基于RNAi技术具有特异性强、对人畜安全、对非靶标生物安全、无害虫抗药性等特点，解决了化学农药长期施用导致“3R”这一难题。因此，RNAi技术将为害虫防治开辟一条新途径。

昆虫在杀虫剂胁迫下，通过诱导高表达酯酶、谷胱甘肽S转移酶、细胞色素P450等方式来进行自身的保护。细胞色素P450酶系是广泛存在于生物体中的一类代谢酶系，是一种多功能氧化酶，具有底物广普性和功能多样性的特点，而细胞色素P450是多功能氧化酶的重要组成部分，起着与底物结合以末端氧化酶的作用，可以代谢多种内源性化合物（保幼激素及其类似物和脂肪酸等）和外源性化合物（药物、植物次生物质及其毒素等），对杀虫剂的代谢是昆虫产生抗药性的主要机制。

目前，有关通过抑制细胞色素CYPB53基因转录水平来防治林木重要害虫舞毒蛾及提高其对有机磷类杀虫剂的敏感性未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种舞毒蛾CYP6B53基因dsRNA及其在无公害防治中的应用，利用分子生物学手段干扰舞毒蛾细胞色素CYP6B53基因，降低了昆虫的生存能力，使其生长发育缓慢，提高了舞毒蛾对有机磷类杀虫剂的敏感性，在舞毒蛾无公害防治中的应用具有广阔的前景并为其他鳞翅目害虫防治提供了理论依据。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种亚洲型舞毒蛾细胞色素P450 CYP6B53基因，其核酸序列如SEQ ID No.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，获得方法如下：

根据NCBI数据库中登陆号为KF853194.1的细胞色素P450序列，设计编码区设计上游引物LdCYP6B53F:5’ ATGTTGTCAATTTATTTACCTATATTTCTCATAGTAGC 3’； LdCYP6B53R: 5’ ATTTGAAGATTTCCTCGGAACAAGTCTTACGTG 3’，通过PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所示序列。

本发明以亚洲型舞毒蛾CYP6B53基因片段为模板，并设计特异的dsRNA引物对，通过MEGAscript RNAi试剂盒合成CYP6B53基因dsRNA，dsRNA序列如SEQ ID NO.3所示。

上述CYP6B53 dsRNA在无公害防治中的应用，主要表现在以下两方面：