[发明专利]舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种亚洲型舞毒蛾的热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA以及基于该基因RNAi技术在亚洲型舞毒蛾防治中的应用。

背景技术

舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)是世界性的害虫，分布广，食性杂，据国外报道可危害300多种植物，国内报道可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500余种植物。舞毒蛾传播快，繁殖量和取食量大，给林业生产造成重大经济损失，如：1974年舞毒蛾在辽宁省南部大发生，将许多蚕场的栎叶食尽，杨、柳、榆、山楂、苹果叶等也受到严重危害。目前对亚洲型舞毒蛾的防治，仍然是以高效氯氰菊酯、溴氰菊酯等化学杀虫剂为主，但这些化合物容易引起害虫抗药性的形成和环境污染问题。尽管一些害虫天敌、致病微生物等生物防治在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但这些防治技术存在受气候环境影响大、见效慢、效果不明显等弊病，严重制约了舞毒蛾防治的发展。然而，随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi技术控制害虫的危害已成为植物保护工作者研究的重点和热点。Napoli等(1990)首次发现RNAi现象，将外源基因引入矮牵牛内会引起内源基因的沉默，当时把这种现象称为“共抑制”。Fire等(1998)阐述了基因沉默现象的本质，将由dsRNA引发生物体同源序列mRNA降解而最终导致特异性基因转录后沉默的效应命名为RNA干扰。RNAi技术已经在农林害虫防治中得到应用。一方面通过基因工程手段将害虫靶标基因dsRNA转入植物体内，当有害生物取食转基因植物时，引发害虫体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的取食能力；例如：Mao等(2007)将含有细胞色素P450相应序列的dsRNA转基因棉花饲喂棉铃虫，导致棉铃虫体内P450基因的表达显著降低，最终使棉铃虫解毒能力下降而死亡。Zha等(2011)将褐飞虱中肠中高表达的己糖转运基因(NlHT1)，羧肽酶基因(Nlcar)，类胰丝氨酸蛋白酶(Nltry)dsRNA转入水稻中，当褐飞虱取食携带这些基因的dsRNA转基因水稻时，未出现致死现象，但靶标基因的转录水平明显下降。另一方面，通过筛选具有致死效应的siRNA(一般来源于生物体内参与重要生物化学途径的候选基因)，并用化学方法合成，可应用于新型的杀虫剂生物农药。基于RNAi技术具有对人畜安全，对防治靶标对象专一，对非靶标生物安全、无害虫抗药性等特点，解决了化学农药长期施用导致“3R”这一难题。

昆虫在杀虫剂胁迫下，通过高表达热激蛋白、细胞色素P450等方式来进行自身的保护。热激蛋白是在应激条件下产生的，具有分子伴侣功能和耐受性功能，是一类生物体内广泛存在且高度保守的超基因家族。依据其编码蛋白相对分子量大小对其进行命名，其中Hsp70和Hsp90家族基因研究广泛而深入。smHsp是一类低分子量蛋白，广泛存在于原核和真核生物体中的一大类分子伴侣家族，已有研究证实参与细胞的生长、发育、分化及增强机体的抗氧化作用。由于smHsp家族基因具有这些重要的生理功能，smHsp研究成为当今细胞生物学、生物化学中一个重要的研究领域。

目前，有关通过抑制小分子热激蛋白基因转录水平来防治林木重要害虫舞毒蛾未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用。本发明利用分子生物学手段干扰舞毒蛾潜在的防御基因Hsp23，不仅降低了昆虫的生存能力，在舞毒蛾无公害防治中的应用具有广阔的前景并为其他鳞翅目害虫防治提供了理论依据，而且能使舞毒蛾热激蛋白基因Hsp23有效的沉默，显著影响舞毒蛾幼虫的生长发育和生理代谢，为无公害、可持续防治舞毒蛾提供了新思路和新材料。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种亚洲型舞毒蛾热激蛋白基因Hsp23，其核苷酸序列和编码氨基酸的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明以亚洲型舞毒蛾Hsp23基因片段为模板，通过MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion)合成Hsp23基因dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述dsRNA在抑制舞毒蛾中的应用，主要表现为调控舞毒蛾生长发育。将该dsRNA微量注射入舞毒蛾3龄幼虫体内，结果表明：Hsp23基因沉默舞毒蛾幼虫8d内体重增加量小于对照ddH₂O，且在3d内体重增加量也小于dsRNAGFP；同时显著影响舞毒蛾营养利用指标，导致相对取食量、食物利用率、近似消化率较对照显著下降(P<0.05)。dsRNA可以高效特异的沉默昆虫体内Hsp23基因的mRNA表达。