[发明专利]用于多重连接扩增技术的探针制备方法

权利要求书

1.一种长探针的制备方法，包括如下步骤：

1)设计一对与待测目的基因及长探针核苷酸序列无关的通用检测引物，分别为上游引物CF和下游引物CR；

2)合成左侧短探针S，5’到3’序列分别由所述上游引物CF序列与目的片段左侧序列TF组成；

3)确定一段与目的基因及通用引物无关的核苷酸序列T，设计一对扩增右侧长探针的引物，分别为LF和LR，其中LF的5’到3’序列分别是由目的片段右侧序列TR与所述T序列5’端的10-25bp碱基组成，LR的5’到3’序列分别由下游引物CR序列与所述T序列3’端的10-25bp碱基的反向互补序列组成，并且LF引物的5’端用生物素标记，LR引物的5’端磷酸化，所扩增的右侧长探针的5’到3’序列依次包含TR、T和CR反向互补序列；

4)利用上述引物LF和LR，以所述的核苷酸序列T为模板进行PCR扩增，获得5’端生物素标记的正义链以及5’端磷酸化标记的互补链形成的双链核苷酸序列；

5)将纯化后的上述双链核苷酸序列与链霉亲和素磁珠混合孵育，使5’端标记生物素的双链核苷酸与磁珠特异性结合；

6)利用外切酶对5’端标记磷酸化的互补链DNA进行酶切；纯化回收5’端标记生物素的正义链DNA，即目的片段的右侧长探针；

或者，上述的步骤2)～4)由下列步骤2’)～4’)替代，以获得目的片段的左侧长探针：

2’)合成右侧短探针Z，5’到3’序列分别由所述目的片段右侧序列TR与下游引物CR的反向互补序列组成；

3’)确定一段与目的基因及通用引物无关的核苷酸序列T，设计一对扩增左侧长探针的引物，分别为LF’和LR’，其中LF’的5’到3’序列分别是由上游引物CF序列与所述T序列5’端10-25bp碱基组成，LR’的5’到3’序列分别由目的片段左侧序列TF的反向互补序列与所述T序列3’端10-25bp的反向互补序列组成，并且LF’引物的5’端标记生物素，LR’引物的5’端标记磷酸化，所扩增的左侧长探针的5’到3’序列依次包含CF正向序列、T和TF；

4’)利用上述引物LF’和LR’，以所述的核苷酸序列T为模板进行PCR扩增，获得5’端生物素标记的正义链以及5’端磷酸化标记的互补链形成的双链核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的长探针制备方法，其特征在于，使用获得的右侧长探针与人工合成的左侧短探针进行MLPA验证；或者，使用获得的左侧长探针与人工合成的右侧短探针进行MLPA验证。

3.根据权利要求1所述的长探针制备方法，其特征在于，所述的右侧长探针的TR序列或者左侧长探针的TF序列的设计中引入了目的片段中存在的核苷酸突变、缺失或者重复位点。

4.根据权利要求1所述的长探针制备方法，其特征在于，步骤1)所述通用检测引物是一对与人类基因组、长探针核苷酸序列及待测靶序列无关的序列。

5.根据权利要求1所述的长探针制备方法，其特征在于，步骤2)所述短探针为人工合成。

6.根据权利要求1所述的长探针制备方法，其特征在于，步骤3)或步骤3’)所述的一段与目的基因及通用引物无关的核苷酸序列T为长探针的可变序列，位于目的片段与通用引物之间，可获得不同长度的探针链；步骤3)所述的引物LF和LR、以及步骤3’)所述的引物LF’和LR’均由根据目的片段序列设计的5’端或3’端和根据所述序列T设计的5’端或3’端组成。

7.根据权利要求1所述的长探针制备方法，其特征在于，步骤4)或者4’)获得的双链核苷酸序列经过纯化后再与链霉亲和素磁珠进行混合孵育；步骤5)获得的纯化后的双链核苷酸序列与链霉亲和素磁珠混合孵育，其中每1份重量份生物素标记的双链核苷酸与1-30份重量份的链霉亲和素磁珠混合，混合后需要回收孵育液进行电泳检测以确认孵育完全并且无双链核苷酸序列残留。

8.根据权利要求1所述的长探针制备方法，其特征在于，步骤6)所述的外切酶为λ噬菌体核酸外切酶，酶切反应中需要回收酶切液进行电泳检测以确认酶切完全并且无双链核苷酸序列残留；步骤5)及步骤6)回收纯化磁珠后需进行PCR验证以确认完全结合。