[发明专利]一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于组织细胞学和组织工程学领域，特别涉及一种体外利用人体细胞制备出组织工程表皮并与真皮细胞结合的组织工程表皮的方法。

(二)背景技术

皮肤是人体面积最大的器官，承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物的侵袭。遗传疾病、烧烫伤、慢性皮肤创伤(如糖尿病)、白癜风、白化病等很多原因会对皮肤造成损害，影响皮肤美观、使皮肤留下疤痕甚至失去生理功能。当皮肤受到严重损害，如深度的大面积烧烫伤时，皮肤不能再进行自我恢复，会失去对细菌的抵御作用，导致大量细菌通过皮肤侵入人体，极易引发全身感染而导致死亡。

目前，最普遍的治疗皮肤烧烫伤的方法是采用手术移植人体自身其他部位没有损伤的皮肤至烧烫伤处，但是这种方法有很大局限性，具体体现在：首先，当皮肤大面积烧伤时，人体自身的正常皮肤来源有限；其次，移植后的皮肤存活率低，这也是临床上皮肤移植面临的重大挑战。

因此，利用体外培养技术来扩增皮肤细胞，在体外构建出组织工程皮肤，并通过组织工程皮肤移植来治疗皮肤创伤具有重要的意义。长期以来，皮肤学专家和皮肤科医生一直致力于具有生理功能的人类皮肤的再生研究。组织工程表皮早在20多年前就用于大面积烧伤的治疗，对提高烧伤病人的成活率起着重要作用，但普通的组织工程表皮产品移植到人体后有很多局限性，如表皮易起水泡不平整、表皮容易过度增生，而且因为没有真皮细胞通常会造成疤痕的收缩，不能形成真正具有完整生理功能的皮肤。因此，目前人工组织表皮除了用于临时覆盖伤口降低死亡率之外，在临床上的应用还比较少。近几年组织工程全程皮(包含表皮和真皮)，即在体外用培养的表皮和真皮细胞结合胶原蛋白而形成的，引起了人们的重视。越来越多的此类产品进入临床应用于创伤愈合，并且获得了较好的疗效。然而，此类组织工程全程皮需要较长的培养时间才能形成皮肤结构，并且目前市场上的此类产品都是异体的组织工程皮肤，存在着排斥问题，而只能用于促进小面积皮肤创伤如糖尿病溃疡的愈合。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种结合真皮细胞、只需获得极少的健康皮肤组织就可以体外增殖出大量的皮肤细胞的带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法，所制组织工程表皮可与人体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促使人体完整表皮结构的形成、不存在免疫排斥反应、可以形成带有毛发、皮脂腺、皮下脂肪等功能性的完整皮肤。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法，包括如下步骤：

(1)表皮细胞和真皮细胞的分离和培养：

(1-a)采集含有表皮和真皮细胞的皮肤组织；

(1-b)将采集的皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗；

(1-c)将冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，冷消化孵育过夜；

(1-d)将孵育过夜的长条状皮肤组织的表皮和真皮分离，并将分离得到的表皮和真皮分别切碎成粘稠状，制得表皮匀浆和真皮匀浆；

(1-e)将表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的表皮匀浆摇散，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的真皮匀浆摇散，制得真皮细胞悬液；

(1-f)向消化完的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分别加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液；

(1-g)将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别用100μm的过滤筛网过滤后，用离心分离法将表皮细胞和真皮细胞分别从表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分离出来；

(1-h)将分离得到的表皮细胞和真皮细胞即元代细胞分别接种并用不同培养基中培养；元代细胞培养5-10天达到80％－100％满进行传代。

(2)表皮细胞和真皮细胞传代：

(2-a)将步骤(1-h)中培养得到的表皮细胞和真皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，分别浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37℃下消化5－15分钟；

(2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞和真皮细胞全部从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培养基中和后使用离心分离法分离一次，向分离得到的表皮细胞和真皮细胞中分别加入含双抗的F12培养基重悬细胞后再次使用离心分离法分离；

(2-c)将分离好的表皮细胞按1:2-3的比例传代，真皮细胞按1:5-10比例传代；通常传1-5代进行冰冻保持或用于步骤(3)和4(c)。