[发明专利]坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列及其克隆方法

权利要求书

1.坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示；

所述核苷酸序列编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示；

所述核苷酸序列通过染色体步移方法克隆得到。

2.如权利要求1所述的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的克隆方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：

步骤一、采用染色体步移方法对坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列进行克隆和测序

(1)根据公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列，设计引物：

SP1：5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，

SP2：5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，

SP3：5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，

SP4：5'-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3'，

SP5：5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，

SP6：5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3'；

(2)以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为上游引物，SP1为第一轮PCR的下游引物，SP2为第二轮PCR的下游引物，SP3为第三轮PCR的下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；PCR反应条件见表1；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:1所示；

表1

(3)以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，SP4为第一轮PCR的上游引物，SP5为第二轮PCR的上游引物，SP6为第三轮PCR的上游引物，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LA PCR Buffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；PCR反应条件见表2；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1023bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

表2

步骤二、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的验证

(1)根据步骤一的测序结果，设计引物：

j1：5'-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3'，

j2：5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3'；

(2)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的验证

以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，j1为上游引物，SP3为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的5'端未知序列；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH₂O；PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ IDNO:3所示；

(3)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的验证

以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，SP6为上游引物，j2为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的3'端未知序列，PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH₂O，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1000bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ IDNO:4所示；

(4)经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列与3'端未知序列的拼接与分析

经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列总长度为1248bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠174个碱基，经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列总长度为1000bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠272个碱基，根据重叠的核苷酸序列，将经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列和经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列拼接在一起，得到总长度为4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:5所示；

利用NCBI在线工具预测4247bp核苷酸序列的开放阅读框，预测结果为4247bp核苷酸序列中含有从ATG到TAA共3372bp的开放阅读框，该坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，编码的1123个氨基酸序列如序列表中的SEQID NO:7所示。