[发明专利]一种用于检测乙型肝炎病毒cccDNA的定性和绝对定量试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种有效检测乙型肝炎病毒DNA以及乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的定性试剂盒和绝对定量试剂盒及其方法。

背景技术

聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction，简称PCR)又称体外酶促基因扩增。由Mullis发明于1983年，它以敏感，特异，快速的核酸分析技术而著称，是分子生物学技术的一项突破。其基本原理为，模拟于DNA的自然复制过程，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA多聚酶的作用下，按照碱基配对的原则(A、T，C、G)，从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性，退火，延伸等一次循环，DNA链数量增加一倍。传统的PCR是基于琼脂糖凝胶电泳的方法对扩增产物进行终点分析的一种半定量、定性方法，其主要的优点是简便易行，而且成本低廉。在PCR定量技术中，常用的实时荧光定量PCR是通过反应过程中荧光信号的累积来反应产物的量，但是荧光定量PCR需要标准品做参照，只是一种相对定量的方法，而且扩增效率的改变也会影响荧光定量PCR的结果。而数字PCR即Digital PCR，它是一种核酸分子绝对定量技术，能够高敏感的对目的DNA进行精确定量。数字PCR可让你能够直接数出目的DNA分子的拷贝数。数字PCR是建立于传统的PCR和荧光探针的使用基础之上，且不需要建立标准曲线，也不需要标准品做参照就能够高灵敏的对核苷酸进行绝对定量。其主要原理是将一个PCR体系分散成20000个油包水的微滴，通过普通PCR的扩增后，具有荧光信号的微滴视为阳性，不具有荧光信号的微滴视为阴性，再通过泊松分布对阳性微滴和阴性微滴进行统计学分析从而对检测样品中目的DNA分子进行绝对精确定量。

乙型肝炎病毒严重危害人类健康，在人体内其主要的复制/生活过程为：乙型肝炎病毒(HBV)与肝表面受体结合，胞质内脱病毒衣壳，其松弛的不完全闭合的环状DNA(rcDNA)进入细胞核，在宿主和病毒DNA聚合酶作用下,以负链DNA为模板,延长修补DNA裂隙区,完成正链两端连接而形成双链完整的cccDNA，cccDNA转录形成4种病毒mRNA，mRNA翻译形成病毒蛋白并逆转录形成单链DNA，再以负链DNA作为模板,通过病毒DNA聚合酶的作用,合成正链DNA,与负链DNA一起组成新的rcDNA。后者再通过病毒表面蛋白(衣壳蛋白)包装形成具备感染能力的病毒颗粒并释放到细胞外。

可见cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，现有的核苷类似物抗病毒药物并不能有效的清除cccDNA，体内一旦存在cccDNA，HBV就有可能再次复制，导致乙肝复发。因此其是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。由于细胞内cccDNA含量较少，检测上相对困难。

国内外对于cccDNA定量检测的方法有很多，基本上都是利用cccDNA两条链均是完整的,而rcDNA存在缺口这个区别，通过荧光定量PCR来实现。

1、巢式聚合酶链反应也称套式PCR。

由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应,第一对引物跨越环状HBV-DNA的DR1、DR2重复序列旁的两个缺刻，第二次PCR以一次PCR产物为模板扩增rcDNA缺口内部区域。其引物设计的原理也是基于cccDNA与rcDNA结构的不同，因此,cccDNA能够被扩增,而rcDNA则不能扩增。董庆鸣等[董庆鸣,魏红山,庄辉,等.套式聚合酶链反应法(nPCR)检测血清中HBV cccDNA[J].中国医学检验杂志,2005,6(3):168-170.]用该法检测HBV cccDNA标准对照质粒,结果表明该法可以检测到5×10⁵拷贝/L HBVcccDNA，但是两步法在取样时容易产生误差，且容易产生污染，并且耗时较长，较繁琐。

2、嵌合引物两步法荧光定量PCR。