[发明专利]一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法

权利要求书

1.一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、胰酶替代物半消化处理：

1)将牙髓从髓腔中取出，经过无菌处理后，将牙髓切割成小块；

2)将上述切块后的牙髓放入无菌EP管中，再向EP管中加入胰酶替代物，然后将放入含有组织块和胰酶替代物的EP管放入37℃培养箱中消化15～20min，每隔5分钟振摇EP管；

二、牙髓组织原代培养：

3)将步骤二消化后的牙髓组织块加入到间充质干细胞完全培养基，充分吹打混匀，得牙髓组织块悬液；

4)将步骤3)的牙髓组织块悬液接种到6孔培养板中，置于37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养10～15d；

三、传代培养：

5)吸出步骤二中培养后的培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

6)采用间充质干细胞完全培养基将步骤5)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的细胞悬液重新接种在培养板中，放入37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养；

四、扩大培养：

7)吸出步骤三中培养后的6孔培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物，放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

8)采用间充质干细胞完全培养基将步骤7)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的细胞悬液重新接种在6孔培养板中；

9)重复步骤7)至8)操作；

五、保存：

10)收集步骤四扩大培养后的牙髓间充质干细胞，然后采用生理盐水清洗牙髓间充质干细胞，吸出生理盐水，加入500μl的胰酶替代物，后放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；消化结束后，采用间充质干细胞完全培养基冲洗培养板，将细胞全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心；离心结束后，弃去上清液，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，将细胞浓度调整至2×10⁶/mL；

11)细胞冻存悬液的配制

向间充质干细胞完全培养基中加入DMSO，二者加入的体积比为间充质干细胞完全培养基：DMSO＝4:1，充分混匀，放入4℃冰箱预冷20min，得牙髓间充质干细胞悬液，将细胞冻存液等比例加入牙髓间充质干细胞悬液中，边加边晃动离心管，使冻存液充分混匀；

12)细胞冻存

将步骤11)的细胞冻存悬液分装到冻存管中，每管加1mL细胞冻存悬液，将冻存管放入程序降温盒中，以1℃/min的速度降至-80℃，24小时之后，将冻存的细胞放入-196℃的液氮中长期保存。

2.根据权利要求1所述的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于胰酶替代物为重组酶，不含动物源成分。

3.根据权利要求1所述的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于间充质干细胞完全培养基的组份为：DMEM/F12基础培养基+10％FBS+1％谷氨酰胺。

4.根据权利要求1所述的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于胰酶替代物的加入量为浸过细胞即可。