[发明专利]日本黄姑鱼微卫星DNA标记

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子标记技术，特别涉及一种日本黄姑鱼微卫星DNA标记。

背景技术

微卫星DNA又称为短串连重复序列(STR)、简单重复序列(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)，是指基因组中以1-6个核苷酸为单位串联重复组成的核苷酸序列；其中，最常见的是双核苷酸重复，如((AC/TG)n及(AG/TC)n。不同的生物个体由于重复基序的重复次数不同而显示出多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)现象造成微卫星DNA多态性信息容量(polymorphic information content，PIC)较高。微卫星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为群体遗传多样性的分析、亲缘关系的鉴定、基因组作图和遗传育种的优越的分子标记，与等位酶、RAPD方法相比也有一定的优越性。由于微卫星具有数量多、在基因组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检测等优点被作为优良的遗传标记(genetic marker)而得到广泛应用。根据重复单元的构成与分布，微卫星DNA序列被分为三种类型：单一型(pure)，复合型(compound)，间断型(interrupted)，例如：

单一型：CACACACACACACACACACA

复合型：CACACACACACAGAGAGAGA

间断型：CACATTCACACATTCATTCA

日本黄姑鱼，俗称黑毛鲿，英文名Giant croaker，拉丁名Nibea japonic，属鲈形目，石首鱼科，黄姑鱼属，为大型优质食用鱼类，主要分布于中国东海、南海及日本南部沿海。近年来，由于捕捞过度、环境污染、生境破坏等原因而衰退，加上渔场缩小等原因，使得当前其自然分布数量十分有限，为恢复和增加日本黄姑鱼野生渔业资源，日本、韩国等分别从上世纪80年代和90年代起就开展日本黄姑鱼的增殖放流工作，我国则相对较晚，从2005年突破日本黄姑鱼全人育苗开始，连续开展了规模化增殖放流工作，年均放流量近百万尾，并取得了一定成效。

随着分子生物学技术和分子遗传学的迅速发展，分子标记作为个体识别工具的优势逐渐凸显出来(1999)，现已成为评估渔业资源增殖放流效果重要而有效的手段之一。日本的Sekino等(2001)利用线粒体DNA和微卫星标记技术对养殖褐牙鲆进行标记，成功地追踪到了放流的褐牙鲆个体。然而，在日本黄姑鱼遗传结构和种质鉴定方面，仅见柴学军等(2007，2009，2013)曾分别利用RAPD标记、线粒体Cyt b基因、16S rRNA和COI基因对日本黄姑鱼和鮸状黄姑鱼进行种质鉴定，初步评价了日本黄姑鱼的遗传多样性。但是上述遗传标记不能提供足够的遗传信息。为了进一步了解日本黄姑鱼亲体、回捕群体的种群结构和遗传多样性等方面的信息，需要开发新的分子遗传标记。

发明内容

本发明提供一种日本黄姑鱼微卫星DNA标记，建立了日本黄姑鱼微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行日本黄姑鱼亲体、回捕个体的分类及遗传多样性的分析。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种日本黄姑鱼微卫星DNA标记，所述的微卫星编号为：NJB01，NJB04，NJB06，NJB15，NJB35；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-5所示。本发明包括日本微卫星(CT)n、(AG)n、(TG)n和(AC)n富集文库的构建，含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到496个含有微卫星重复序列的克隆，确定了6个多态性丰富的微卫星标记NJB01，NJB04，NJB06，NJB15，NJB35；NJB01为836个核苷酸、NJB04为440个核苷酸、NJB06为927个核苷酸、NJB15为310个核苷酸、NJB35为681个核苷酸。

作为优选，所述的NJB01、NJB04、NJB06、NJB15、NJB35六个位点的引物序列为，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：6-17所示：

NJB01F：TTACATTCAGCAGGTATAGACAC

NJB01R：TTAACAGGTAGCCAATGCAAAGA

NJB04F：AAATTTGCTCCTGACCGACCAC

NJB04R：CGAGACCAAACCGTAAGAGTTGTA

NJB06F：CCCCTCCAACAAATCAACCCTT