[发明专利]一种大肠埃希氏菌株HY‑05C高密度培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养方法。

背景技术

天冬氨酸又称氨基丁二酸，是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一。天冬氨酸是生命体中合成赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的前体。L-天冬氨酸参与鸟氨酸循环，促进氨和二氧化碳生成尿素，降低血液中氨和二氧化碳的含量，增强肝功能，可用做氨解毒剂、肝机能促进剂、疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂。天冬氨酸与L-苯丙氨酸合成的二肽甜味剂阿斯巴甜，甜度高、热量低，适于糖尿病、高血压等患者，安全可靠；以L-天冬氨酸为原料合成的新型强力甜味剂纽甜，不仅适用于包括儿童、孕妇、哺乳期妇女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者内的所有人群，还适用于不能食用阿斯巴甜的苯酮尿症患者。

目前L-天冬氨酸主要是由产L-天冬氨酸的游离整体细胞一步转化富马酸生产。生产过程大体如下：首先培养产L-天冬氨酸酶的菌体细胞，然后再将菌体培养液加入到含有富马酸铵的转化体系中，富马酸铵在L-天冬氨酸酶的作用下转化生成L-天冬氨酸铵，转化完成后再通过酸解、等电点结晶等得工序得到成品L-天冬氨酸。提高单位体积菌体培养液的酶活力是提高转化效率的关键。提高单位体积培养液中的酶活性主要有两种方法，一是通过菌种诱变提高菌体的产酶能力。另外，就是通过培养基和培养条件的优化，提高单位体积培养液中产酶菌体细胞个数，即增加培养液中菌体细胞浓度。

申请人拥有游离整体细胞转化生产L-天冬氨酸的专利菌株(大肠埃希氏菌株HY-05C，保藏编号为CGMCC No.5450)和技术(专利号：201110382584.X)，本发明在原有技术的基础上，提供一种提高大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度(高细胞浓度)的培养方法，提高单位体积培养液中产酶菌体细胞的浓度(数量)，进而提高单位体积培养液中的L-天冬氨酸酶活力。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种高密度培养大肠埃希氏菌株HY-05C的培养基和培养方法，通过提高单位体积培养液中菌体细胞浓度来提高培养液天冬氨酸酶酶活量，从而提高单位体积细胞培养液转化富马酸生产天冬氨酸转化效率。

所述的大肠埃希氏菌株HY-05C来自烟台恒源生物股份有限公司前期选育的L-天冬氨酸游离细胞转化法生产菌(记载在申请号为CN201110382584.X，申请日为：2011年11月25日，发明名称为：“高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌株及其应用”。大肠埃希氏菌株HY-05C保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5450，保藏日期为2011年11月8日。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，将大肠埃希氏菌株HY-05C进行液体培养，包括如下步骤：

1)菌株HY-05C斜面菌种活化：将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化培养基试管斜面中，35-37℃培养24-36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化用试管斜面中，35-37℃培养24-36小时，再转接另一斜面，35-37℃培养24-36小时即得活化斜面菌种。

2)制备菌株HY-05C一级种子液：取步骤1)得到的大肠埃希氏菌株HY-05C活化斜面菌种，接种到装有高密度培养培养基的三角瓶中进行培养，200rpm、35～37℃、摇床培养6-8小时，得到一级种子液。

3)制备菌株HY-05C二级种子液：取步骤2)得到的一级种子液以体积比1-2‰接种量转接到装有高密度培养培养基发酵罐中进行扩大培养，控制通风比0.3-0.6vvm，相对溶解氧浓度20-40％，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压0.05-0.08MPa，35～37℃培养7-9小时，得到大肠埃希氏菌株HY-05C二级种子液。

4)制备菌株HY-05C转化用培养液：将步骤3)培养好的大肠埃希氏菌株HY-05C二级种子液以体积比5-10％接种量转接到高密度培养培养基中进行扩大培养，控制通风比0.15-0.25vvm，相对溶解氧浓度20-40％，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压0.05-0.08MPa，35～37℃培养8-10小时，制得大肠埃希氏菌株HY-05C转化用培养液。

上述的活化斜面培养基所必需的营养物质包括(g/L)：富马酸铵10；牛肉膏10；蛋白胨7；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，琼脂15～20，pH7.0～7.2。