[发明专利]检测猪轮状病毒的LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猪轮状病毒的LAMP检测试剂盒。

背景技术

猪轮状病毒(PoRV)与小肠上皮细胞接触并定殖，大量上皮细胞被感染和破坏，小肠内的营养物质的吸收障碍。导致小肠内液体的滞留，小肠内渗透压增高，导致从机体组织中吸收液体，引起腹泻与脱水症状，死亡的最终原因可能是脱水、代谢性酸中毒和高血钾导致的心、肾功能衰竭。由猪轮状病毒(PoRV)引起的猪腹泻性在临床上比较少见，猪轮状病毒的感染发病的轻重与日龄的关系也不大，感染后常呈现水样或糊状腹泻，粪便颜色为黄白色或暗黑色，临床症状的轻重与发病日龄、环境条件及有无母源抗体保护有关。若有母源抗体的，一般不易感染发病或临床症状轻微，死亡率较低；若环境温度低、继发致病性大肠杆菌感染或其它腹泻病毒的感染、无母源抗体保护，感染发病严重，死亡率增高。

传统的检测方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过长。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是众多核苷酸扩增技术(the nucleic acid amplifications tests，NATs)中的一种。自从Notomi等研究者于2000年公布该技术以来，该技术已经被广泛地应用于生命科学领域，其中就包括对病原体感染的检测。当研究者将该技术应用于检测各种病原体的同时，也对该技术提出了很多的改进，使得该技术逐步完善，能够成功地被应用于如疟疾、锥虫病、泰勒尔梨浆虫病和巴贝虫病等疾病病原体的检测。LAMP核酸扩增是在等温条件下进行的，不需要特殊的仪器，可以肉眼观察结果，操作简单。

公开号103451315A的专利申请也公开了采用RT-LAMP检测猪轮状病毒的方法，其能够检测的猪轮状病毒的最低检测限为10pg/μl。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可检测猪轮状病毒的试剂盒。

本发明检测猪轮状病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～4所示引物，特异扩增猪轮状病毒的基因。

其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：5所示的基因片段。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在扩增猪猪轮状病毒的基因中的用途。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备检测猪轮状病毒的试剂中的用途。

其中，所述检测猪轮状病毒的试剂是环介导等温扩增猪轮状病毒的基因的试剂。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：5所示的基因片段。

本发明设计的两对引物，用LAMP技术可以特异有效地扩增猪轮状病毒的基因，病毒的最低检测浓度为8.38×10^-5pg/uL，最低检测限比现有方法低了5个数量级，灵敏度高，且特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 dNTPs对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-7依次对应dNTPs的剂量为:0.5、1.0μL、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL。

图2 MgSO4对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-7依次对应MgSO4的剂量为:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL。

图3 Bst DNA聚合酶对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应Bst大片段DNA聚合酶的剂量为:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL。

图4甜菜碱对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-7依次对应甜菜碱的剂量为:0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL。

图5反应温度对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应反应温度为:58、59、60、61、62、63、64、65℃。

图6内引物浓度对LAMP反应的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-6依次对应内引物浓度的剂量为:0、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL。