[发明专利]猪流行性腹泻病毒的LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的LAMP检测试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻病在猪群中的传播速度较猪传染性胃肠炎慢，死亡率也较低，但最近一两年报道，猪流行性腹泻病毒(PEDV)发生变异，死亡率有所增高。哺乳仔猪感染猪流行性腹泻病毒的主要临床症状为：发生水样腹泻并伴有呕吐而导致严重脱水、消瘦、眼窝下陷等症状；粪便较稀，颜色为黄色或灰白色，呕吐多发生于吃奶或进食后；发病猪只一般在5天左右死亡，有的猪场哺乳仔猪的死亡率可高达90％。断奶仔猪与保育猪感染流行性腹泻病毒后症状较轻，常呈现精神沉郁、厌食、拉稀、呕吐等临床症状，如护理得当，猪场比较洁净，无其它疾病续发感染，则死亡率较低，约在10％-20％；育肥与后备猪感染呈现一过性特点，很少发生死亡，一般3-7天可以自然康复。剖检的主要病理变化主要小肠极度膨胀，肠壁呈半透明状，肠系膜淋巴结水充血，胃充满白色乳凝块，小肠内容物稀薄，含有大量的淡黄色液体，小肠绒毛缩短。

传统的检测方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过长。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是众多核苷酸扩增技术(the nucleic acid amplifications tests，NATs)中的一种。自从Notomi等研究者于2000年公布该技术以来，该技术已经被广泛地应用于生命科学领域，其中就包括对病原体感染的检测。当研究者将该技术应用于检测各种病原体的同时，也对该技术提出了很多的改进，使得该技术逐步完善，能够成功地被应用于如疟疾、锥虫病、泰勒尔梨浆虫病和巴贝虫病等疾病病原体的检测。LAMP核酸扩增是在等温条件下进行的，不需要特殊的仪器，可以肉眼观察结果，操作简单。

郑新添等，“环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒”，中国预防兽医学报，2014年10月第36卷第10期，公开了一种采用RT-LAMP检测猪流行性腹泻病毒的方法，其能够检测的猪流行性腹泻病毒的最低检测限度为16copies/μL。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒。

本发明检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～4所示引物，用于环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因。

其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的用途。

其中，所述检测猪流行性腹泻病毒的试剂是环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因的试剂。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因的试剂中的用途。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

本发明设计的引物，用LAMP技术可以特异有效地扩增猪流行性腹泻病毒的基因，病毒的最低检测浓度为15copies/μL，最低检测限度略低于现有方法，灵敏度略高，同时，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 dNTPs对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应dNTPs的剂量为:0.5、1.0μL、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μL。

图2 MgSO4对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应MgSO4的剂量为:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL。

图3 Bst DNA聚合酶对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-9依次对应Bst大片段DNA聚合酶的剂量为:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL。