[发明专利]用于筛选水稻耐旱品种的snoRNA基因分子标记的引物

说明书

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域，尤其涉及一种用于筛选水稻耐旱品种的snoRNA基因分子标记的引物。

背景技术

水资源短缺是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有43％的耕地为干旱、半干旱地区。干旱逆境严重影响植物的生长发育，造成作物减产。我国属贫水国家，水资源供需矛盾十分尖锐，近年来，缺水将是我国面临的最严重的问题之一。且在农业生产中，经常会出现频繁的干旱，对粮食生产造成巨大的损失，全世界每年因干旱而造成的粮食生产的损失几乎等于其它所有环境因子造成损失的总和。

核仁小分子RNA(snoRNA)是一类小分子非编码RNA，其可能通过调整rRNA折叠以及与核糖体蛋白的相互关系，对核糖体的生物合成和活性起到调节作用。

虽然snoRNA基因在植物生命活动中起着重要的作用，但目前对其在植物逆境中的作用还知之甚少。我们发现耐旱品种Oryza sativa Z257snoRNA基因在干旱逆境中上调表达，而在干旱敏感品种中该基因表达活性未发生变化。对该基因我们进行了实时PCR研究，在干旱胁迫下不同品种的水稻根系检测了该基因的表达变化，结果表明该基因也仅在耐旱性强的品种中上调表达，由此我们推断该snoRNA基因在水稻干旱胁迫时发挥重要的调控作用，可以成为抗旱选择指标。因此我们通过该基因设计分子标记，用于耐旱品种快速筛选。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于筛选水稻耐旱品种的snoRNA基因的分子标记的引物。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种上述引物用于制备筛选水稻耐旱品种的snoRNA基因的分子标记的方法。

本发明要解决的还有一个技术问题是提供一种上述引物在筛选水稻耐旱品种方面的应用。

对于用于筛选水稻耐旱品种的snoRNA基因的分子标记的引物，本发明采用的技术方案是：引物是具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的反向引物。

对于上述引物用于制备筛选水稻耐旱品种的snoRNA基因的分子标记的方法，本发明采用的技术方案是包括以下步骤：

(1)DNA的提取：剪取水稻品种的新鲜叶片，使用组织研磨机研磨好后，利用植物DNA提取试剂盒提取DNA；

(2)PCR扩增：利用25μl的反应体系进行扩增，其中引物为1μl、模板为1μl、Tap酶为0.3μl、DNTP为2μl、Buffer为2.5μl、Mg²⁺为2μl、双蒸水为15.2μl，总计为25μl；

反应参数为：95℃预变性5min，再按95℃变性30s、55℃复性50s、72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸5min；

(3)扩增产物检测：使用3％的琼脂糖电泳检测，电泳电压120V，电泳使用TBE缓冲液，使用EB替代核酸染料检测；

(4)电泳条带分析：使用凝胶成像系统，分析不同品种扩增条带，耐旱品种会扩增出约400bp大小的条带，而干旱敏感品种没有该条带；由此分辨品种耐旱性。

本发明的有益效果是：

通过本发明应用在水稻耐旱品种筛选上，可以快速准确的筛选出耐旱品种，减少耐旱品种筛选工作量，避免环境因素和人为失误造成的筛选偏差，在耐旱生产和耐旱机理研究中有非常广泛的实用价值。

具体实施方式

以下是一种使用水稻snoRNA基因的分子标记筛选耐旱品种方法，其具体实施步骤如下：

1、引物设计

依据Oryza sativa Z257snoRNA基因序列设计引物，引物序列：

正向引物：5‘CACCCGTTTCAACTCCACGC3‘，

反向引物5’TCAGGGCGAAGACTGGATGG3‘

2、PCR反应体系

25μl的反应体系进行扩增，其中引物为1μl、模板为1μl、Tap酶为0.3μl、DNTP为2μl、Buffer为2.5μl、Mg²⁺为2μl、双蒸水为15.2μl，总计为25μl。

循环参数为95℃预变性5min，再按95℃变性30s、55℃复性50s、72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸5min。

3.检测实例

(1)干旱处理