[发明专利]一种罗非鱼源无乳链球菌重组GPI蛋白疫苗的制备及应用

权利要求书

1.一种来源于罗非鱼的无乳链球菌GPI基因编码的重组GPI蛋白，其特征在于：所述的GPI重组蛋白的编码基因是从罗非鱼的无乳链球菌中克隆得到的，所述罗非鱼的无乳链球菌重组GPI蛋白具有氨基酸序列为序号1。

2.一种如权利要求1所述的来源于罗非鱼的无乳链球菌重组GPI蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：

以来源于罗非鱼的无乳链球菌为模板，设计一对包含限制性内切酶的引物GPI-F和GPI-R，序列如下：

GPI-F：5’-CGCGGATCCATGACACATATTACATTTGAC-3’

GPI-R：5’-CCGCTCGAGTTAAAGACGTGCATTCAATTC-3’

上游引物GPI-F下划线部分是BamH I酶切位点，下游引物GPI-R下划线部分是Xho I酶切位点。

(2)GPI基因克隆

提取来源于罗非鱼的无乳链球菌基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系为：25μl反应体系含1μl模板DNA，1μl 10×PCR Buffer，1μl dNTP，0.5μM GPI-F，0.5μM GPI-R，0.25μl rTaq，加灭菌蒸馏水至25μl。PCR条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min下作用30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物回收纯化后与pMD18-T载体连接，16℃下连接12h。连接体系为：10μl体系内含4μl PCR产物，1μlpMD18-T Vector，5μl Solution I。将10μl连接产物转入50μl大肠杆菌TG1感受态细胞，冰浴30min，42℃热激60s，然后加入840μl LB液体培养基，37℃震荡培养2h，取100μl混合液加入含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体培养基上，涂布均匀后在37℃培养24小时。随机挑取平板上的10个单菌落进行 菌落PCR鉴定，鉴定结果为阳性的单菌落即为GPI克隆菌株。

(3)重组质粒pET28-GPI的构建

提取GPI克隆菌株质粒，将质粒和表达载体pET28a(+)分别用BamH I和Xho I进行双酶切，双酶切体系为：100μl总体积含10μl 10×Buffer，5μl BamH I，5μlXho I，30μl质粒或pET28a(+)，50μl不含核酸酶的水。37℃水浴12h。将酶切产物胶回收，连接GPI基因片段和pET28a(+)，16℃连接12h，连接体系为：10μl连接体系含4μl GPI基因片段、1μl pET28a(+)、0.5μl T4DNA连接酶、1μl T4DNA连接酶缓冲液。将连接产物转入大肠杆菌TG1感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET28-GPI的工程菌。

(4)重组质粒pET28-GPI在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化：

提取重组质粒pET28-GPI，转化E.coli BL21(DE3)表达型感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆菌株。将含有重组质粒pET28-GPI的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，24℃下200r/min震荡培养至OD₆₀₀约为0.6，向菌液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，24℃震荡培养12h。离心收集过夜诱导的菌体，灭菌PBS重悬，再加入终浓度1mg/mL的溶菌酶，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液中的重组GPI蛋白，先用含有20mmol/L咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/L咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。洗脱的重组蛋白用10ku超滤管超滤，除去洗脱液中的咪唑，得到纯化的重组GPI蛋白。所述罗非鱼源无乳链球菌重组GPI蛋白具的氨基酸序列为序号1。

(5)Western blot检测

纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，100mA恒流条件下将胶上的蛋白电 转至NC膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭12h。用TBST洗膜后，依次加入无乳链球菌免疫后罗非鱼血清，鼠抗罗非鱼IgM单克隆抗体和HRP标记的兔抗鼠IgG单克隆抗体进行孵育。反应结束后，将NC膜放入新鲜配制的DAB显色液中，避光显色至条带出现，用ddH₂O中终止显色。

3.如权利要求1或2所述的来源于罗非鱼的无乳链球菌重组GPI蛋白的应用，其特征在于：重组GPI蛋白作为抗罗非鱼无乳链球菌病疫苗用于注射免疫，包括以下步骤：

(1)疫苗制备：

将纯化的重组GPI蛋白用灭菌PBS稀释至50μg/mL，与弗氏完全或不完全佐剂按1∶1混合均匀制备成亚单位疫苗。取1mL制备好的疫苗，在3000×g下离心5min，疫苗无分层现象，则可用于后续免疫。

(2)免疫程序

初次免疫时，每尾鱼腹腔注射100μL疫苗，使用弗氏完全佐剂亚单位疫苗。两周后，每尾鱼腹腔注射100μL疫苗进行加强免疫，使用弗氏不完全佐剂亚单位疫苗。加强免疫两周后，用LD₅₀剂量进行细菌攻毒实验。

(3)免疫保护率测定

细菌攻毒后记录罗非鱼的死亡情况，若连续7天不死鱼，则停止观察，实验结束。计算罗非鱼的相对保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。重组GPI蛋白作为抗罗非鱼无乳链球菌病疫苗用于注射免疫可获得50.98％的免疫保护率。