[发明专利]检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒，其盒体内设置酶联反应板、酶标结合物、浓缩洗涤液、底物液、显色液、浓缩样品稀释液、终止液；其特征在于，所述酶联反应板包被了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体；所述酶标结合物为辣根过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体的酶标结合物。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶联反应板是在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体，然后在4℃静置12～24小时，冷冻真空干燥后装袋封口制成；其中，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体是用重组N蛋白免疫实验动物后，所得抗血清或腹水经蛋白A柱纯化后获得；包被液为10μg/ml抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体的缓冲液，所述缓冲液是0.01mol/L～0.15 mol/L的磷酸盐、硼酸盐或碳酸盐缓冲液，pH7.5～pH9.5。

3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标结合物为用重组N蛋白免疫实验动物后，所制得的抗体采用辣根过氧化物酶进行免疫标记制成。

4.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标结合物是含0.05%～1%的辣根过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体的0.01mol/L～0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH6～8；并且添加含量足以抑制细菌生长的防腐剂。

5.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，其还至少包括阴性对照品、阳性对照品其中之一。

6.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为包含有0.1%～1%表面活性剂的0.01mol/L～0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6～8；底物液为0.1%～0.5%过氧化氢溶液；显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；样品稀释液为0.01mol/L～0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6～8；终止液为1 mol/L～2 mol/L的硫酸或氢氧化钠。

7.一种用于权利要求1所述的ELISA试剂盒的检测方法，其包括步骤：

A1、用重组N蛋白免疫实验动物后，所得抗血清或腹水经蛋白A柱纯化，获得抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体，在通用聚苯乙烯微孔板上包被所述抗体，然后在4℃静置12～24小时，冷冻真空干燥后制成酶联反应板，并装袋封口保存；其中，包被液是含有0.01%~1%所述抗体的缓冲液，所述缓冲液是pH7.5～pH9.5的0.01 mol/L～0.15 mol/L的磷酸盐、硼酸盐或碳酸盐缓冲液；

A2、用重组N蛋白免疫实验动物后，所制得的抗体采用辣根过氧化物酶进行免疫标记制成酶标结合物；

A3、所述酶联反应板每孔分别加工作浓度的样品稀释液50μl，再加入待检的样本50ul，混匀；其中，所述样品稀释液为0.01mol/L～0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6～8；

A4、充分反应后甩去孔内液体，每孔注满（若用洗板机每孔加250μl）工作浓度洗涤液洗涤6次，每次均需停留1分钟；最后一次甩净，拍干；其中，所述洗涤液为包含有0.1%～1%表面活性剂的0.01mol/L～0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6～8；

A5、每孔加酶标结合物100μl，充分反应后甩去孔内液体，每孔注满（若用洗板机每孔加250μl）工作浓度洗涤液洗涤3次，每次均需停留1分钟；最后一次甩净，拍干；

A6、按所需用量，临用前取等体积底物液和显色液充分混匀后每孔加100μl，盖好封板膜，充分显色反应后加终止液50μl，混匀，终止反应；其中，所述底物液为0.1%～0.5%过氧化氢溶液；所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；所述终止液为1 mol/L～2 mol/L的硫酸或氢氧化钠。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤A3中，还包括步骤：设置阴性孔、阳性孔及空白对照孔，阴性孔、阳性孔分别加工作浓度的样品稀释液50μl，然后分别加入阴性对照品、阳性对照品各50μl，空白对照孔加入工作浓度的样品稀释液100μl。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述充分反应为37℃避光反应30-60分钟，所述充分显色反应为37℃避光反应15分钟。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤A1中，在4℃静置12～24小时之后，还包括步骤：采用0.1%～5%卵清蛋白或牛血清白蛋白封闭2小时，经冷冻真空干燥后制成所述酶联反应板。