[发明专利]一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡及制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡，由以下组成：卡体(1)、加样孔(2)、检测线(3)、检测窗孔(4)、质控线(5)、样品垫(6)、支撑背板(7)、金标结合垫(8)、硝酸纤维素膜(9)、吸水垫(10)、底板(11)，其特征在于：硝酸纤维素膜(9)粘贴在底板(11)上面，在硝酸纤维膜(9)的一端有金标结合垫(8)和样品垫(6)，硝酸纤维素膜(9)的另一端粘贴有吸水垫(10)；依次为样品垫(6)、金标结合垫(8)、硝酸纤维素膜(9)、吸水垫(10)，且各垫相接处分别部分重合；硝酸纤维膜(9)上的检测线(3)包被有猪伪狂犬病病毒鄂A株，质控线(5)包被有羊抗鼠IgG，检测线(3)与质控线(5)相互平行，相距6～8mm，与免疫胶体金试纸条的长相垂直，检测线(3)靠近金标结合垫(8)一端，质控线(5)靠近吸水垫(10)一端；免疫胶体金试纸条放置于卡体中，检测线(3)和质控线(5)设置在检测窗孔(4)所对应的位置，加样端与加样孔(2)位置相对应；

所述的金标结合垫为金颗粒标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体；

所述的样品垫(6)与金标结合垫(8)为缓冲液处理过的吸水纸和玻璃纤维，缓冲液的配方为：含0.5％(w/v)牛血清白蛋白，3％(w/v)蔗糖，0.5％(v/v)吐温-20的10mmol/L的PBS，PH8.5。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡的制备方法，其步骤是：

A.制备并纯化猪伪狂犬病病毒：将-78～-82℃保存的伪狂犬病病毒鄂A株取出，按0.5个MOI接种pK-15细胞，出现90％细胞病变后收毒，将病毒液反复冻融2～4次，56℃灭活，将病毒液8000rpm离心，弃沉淀，并将离心后的上清液放入洁净的烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下，将硫酸铵按41.5～43.5g每100ml的剂量加入烧杯中的病毒液中，搅拌过夜，低温高速12000rpm、4℃离心10min，弃掉上清，沉淀用10mM PH9.0Tris-HCL重悬；用10mM PH9.0Tris-HCL为透析液，在4℃下透析22～26h，其间多次更换透析液，透析完全后回收透析袋中病毒液，27000rpm超高速离心，沉淀用1/5体积的10mM PH9.0Tris-HCL重悬，蔗糖密度梯度离心，收集不同条带的病毒并超速离心脱糖，将不同条带病毒用病毒保护剂重悬，保存备用，所述病毒保护剂为含有3％(w/v)蔗糖，0.2％(w/v)牛血清白蛋白的10mM PH7.2PBS溶液；

B.制备金标结合垫，其方法如下：

(1)所述的猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞2E6分泌的，杂交瘤细胞2E6制备方法为：采用杂交瘤细胞技术，用纯化的猪伪狂犬病病毒鄂A株免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用猪伪狂犬病病毒鄂A株和伪狂犬病病毒gE/gI基因缺失株进行间接免疫荧光筛选，筛选后的阳性细胞经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬病病毒感染的阳性对照血清和猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗免疫的阴性对照血清进行ELISA筛选，最终筛选出单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为杂交瘤细胞2E6；

(2)制备猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体：将2E6细胞接种于经液体石蜡处理过一周以后的Balb/C小鼠腹腔内；7～10天后，待小鼠腹部明显隆起，收取小鼠腹水；4℃条件下10000rpm离心10min，取上清即为腹水；辛酸-硫酸铵两步沉淀法纯化腹水，测定浓度后分装并冻存于-78～-82℃冰箱中；

(3)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金溶液：取110ml超纯水，倒入已硅化好的平底蓝盖瓶中，加入1.0ml 1％w/v氯金酸，混匀，将蓝盖瓶放在磁力搅拌加热器的加热套内，放入洁净的磁力搅拌子，调节转速为150r/min，打开加热旋钮，加热至沸腾，继续加热2min，迅速的一次性加入1.75ml 1％w/v柠檬酸三钠溶液，继续加热14～16min，直至溶液变为亮葡萄红色，停止加热，溶液自然冷却至室温，用超纯水将胶体金溶液体积补平至100ml，通过分光光度计扫描在450-600nm处光谱，测得最大吸收波长为523nm，电镜下观察金颗粒大小均匀，直径为30nm；

(4)金颗粒标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，制备金标结合垫：将上述步骤(3)所得的胶体金用0.2mol/LK₂CO₃调节pH值到8～8.4；加入上述步骤(2)所得的单克隆抗体，搅拌28～32min后，加入10％BSAw/v溶液继续搅拌2h之后，将溶液在4℃条件下以9000rpm离心30min，弃掉上清，沉淀用1/5原体积重悬液重悬，将重悬液喷涂在金标结合垫上，所述的重悬液为含有3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)吐温-20的5mM PH8.5PB溶液；

C.将纯化的猪伪狂犬病病毒鄂A株和兔抗鼠IgG抗体分别稀释到浓度2mg/ml和1mg/ml，喷涂在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线的位置；

D.将底板、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫、吸水垫按顺序粘合在一起组成得到检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的免疫胶体金试纸条；

E.免疫胶体金试纸条放置于在卡体中，组装好试纸卡，检测线和质控线设置在检测窗孔所对应的位置，加样端与加样孔位置相对应。

3.权利要求1所述的一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡在制备猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体检测试剂盒中的应用。