[发明专利]一种用于猪圆环病毒检测的方法及引物组

说明书

技术领域

本发明的领域涉及一种猪圆环病毒的检测的方法，尤其涉及一种在轮状病毒疫苗中检测猪圆环病毒的方法。

背景技术

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14～25nm，平均直径17nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组为单股环状DNA。其在组织中的悬浮密度为1.37cm³，沉降系数为52S，是目前发现的最小的动物病毒。PCV对外界的抵抗力较强，该病毒对氯仿不敏感，不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。

根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，PCV被分为PCV—1和PCV—2。PCV—1无致病性，1974年由德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现，1982年证实该病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织。后来证实该病毒只是一种可以感染猪的普通病毒，不会对感染猪造成危害。PCV-2却具有致病性，能引起猪表现多种临床症状。

2010年3月22日，美国FDA宣布暂停GSK公司生产的轮状病毒疫苗Rotarix的使用，因为在该疫苗存在猪圆环病毒1型(PCV1)DNA的污染。这一结论是在Eric Delwart博士的实验室采用称为深度测序(Deep sequencing)的新技术得到的。但是深度测序在应用上也存在一定缺陷，这主要包括检测方法复杂、费用高昂等。

同时，GSK和FDA随后进行的检测也证实了该疫苗中确实存在这种DNA。2010年5月6日，FDA宣布RotaTeq(由默克公司生产)中查出含有猪圆环病毒I型(PCV1)以及猪圆环病毒II型(PCV2)中的DNA片段。这两种疫苗原本有着极好的安全记录。目前为止，还没有证据表明这2种疫苗中存在的PCV在人体中会引起感染，但是这种动物来源的病原的存在终会是有风险的，这也提示对于疫苗质量的控制很重要。

故如何在轮状病毒疫苗中有效检测猪圆环病毒，从而提高疫苗纯度成为了亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对以上问题分别设计了I型和II型PCV的通用半巢式PCR引物及各型PCV的特异性巢式PCR引物，建立了一种猪圆环病毒的检测方法，经序列测定证实该方法快速、特异和有效。

本发明的一方面在于提供一种猪圆环病毒的检测方法，其中猪圆环病毒包括I型及II型病毒，该方法包括：

对样品提取DNA,并进行第一PCR；以及

就第一PCR所获得的扩增产物进行第二PCR，本申请提供了以下这些引物组，具体为：

第一PCR所使用的引物包括第一引物组，第二引物组及第三引物组，

第二PCR所使用的引物包括第四引物组，第五引物组及第六引物组，

其中，

第一引物组包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:2所示序列的下游引物，

第二引物组包括如SEQ NO:3所示序列的上游引物，及如SEQ NO:4所示序列的下游引物，

第三引物组包括如SEQ NO:5所示序列的上游引物，及如SEQ NO:6所示序列的下游引物，

第四引物组包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:7所示序列的下游引物，

第五引物组包括如SEQ NO:8所示序列的上游引物，及如SEQ NO:9所示序列的下游引物，

第六引物组包括如SEQ NO:10所示序列的上游引物，及如SEQ NO:11所示序列的下游引物。

其中，前述检测的样品为轮状病毒口服活疫苗、3价轮状病毒重配疫苗、小牛血清、培养基、细胞消化用胰酶、病毒消化用胰酶、和/或Vero细胞。

其中，前述方法还包括对所述第二PCR扩增之后的产物进行定性分析。定性分析包括用凝胶电泳显示所述第二PCR扩增之后的产物。

本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组为通用引物组，其可以检测包括I型和/或II型病毒在内猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:2所示序列的下游引物。

本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组为通用引物组，其可以检测包括I型和/或II型病毒在内猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:7所示序列的下游引物。