[发明专利]一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法。

背景技术

在平均1万至2万5千个独立化合物中才能够产生一个创新药物，成本高达10-17亿美元。导致大批先导化合物被淘汰和候选药物研发中止的原因中除了药效学不显著外，接近50％的药物研发中止归因于药物毒性作用，由于药物对患者的毒性从市场收回药物的事件也曾出不穷，不仅造成巨大的经济损失，也导致生命的损失。因此，国际制药界一直在研究在新药研发的早期阶段对新化学物进行毒性筛选的准确可靠、快速灵敏的方法体系，从而及时发现和淘汰有潜在毒性的化学物或化学结构，尽可能缩短新药研发的时间并减少成本和风险。

现在的毒性检测体系，包括对药物毒性的监测技术、细胞模型和动物模型对药物的毒性预测并不理想。这也是目前国际制药界毒性预测面临的困境之一。在动物模型方面，主要是由于动物在药物吸收、转运、代谢、清除等过程的基因与人类的种属差异，包括基因结构、表达谱、调控，以及基因数目的不同等造成的对药物毒性反应的差异。例如，曲格列酮(Troglitazone)为治疗糖尿病的口服药，动物实验结果十分理想。然而，在进入市场之后FDA很快收到多例肝毒性临床报告。该药被FDA于2000年3月撤出市场，目前仅仅在研究领域作为试验用阳性药。在2005-2010六年间，由于患者使用中的肝、肾、神经、心脏等毒性被撤回典型药物就有10起以上，不经造成了巨大的经济损失，也有生命的损失。

所以，用人类的药物吸收、转运、代谢、清除等过程的基因替代动物的对应基因，建立基因结构、表达谱和调节方式与人类相似的模型，即人源化动物模型，是解决这一问题的有效途径之一。对缩短新药研发的时间并减少成本和风险具有重要的意义。

药物相关的基因可分为药物代谢相关的酶，药物结合相关的受体、药物转运相关的膜通道，信号传导等相关基因100余种。国外一些药物公司已经开始人类药物相关基因人源化小鼠的研究，研制了CYP3A Cluster，CAR，AHR等十余种药物基因人源化小鼠，并应用于药物代谢和安全评价的研究。目前这些人源化小鼠的专利都在国外一些药物公司手中，限制了我国医药研究机构的使用。另外，小鼠不是CFDA认可的药物评价动物，在表达谱的差异和基因调控方面仍然与人类有较大的差异。从药物评价的科学意义上，建大鼠等CFDA规定的人源化模型，有更广阔的需求。且随着TALEN和CRISPR/Cas9基因组编辑技术的成熟，基因组修饰不再依赖胚胎干细胞的基因打靶，使大鼠的人源化成为可能。大鼠再次成为生物医药研究的“宠儿”，欧美等国正在运作大规模大鼠模型资源研究，企图抢占大鼠模型的知识产权和控制由此带动的医药创新成果。

P-糖蛋白是一种相对分子量为170 000的单链跨膜糖蛋白，由多药耐药基因Abcb1(又称Mdr1)编码，最早发现于肿瘤细胞中，但随后的研究表明其广泛存在于机体的各个组织，参与药物吸收、分布、代谢及排泄等过程。P-糖蛋白能利用机体中的ATP将已进入细胞的外源性的药物毒物转运出来，降低细胞内药物毒物浓度。在生理状态下，P-糖蛋白的存在可保护机体安全，而在病理情况下，P-糖蛋白于血脑屏障的表达使得药物不能进入中枢神经系统，于肿瘤细胞中的表达致机体产生多药耐药现象，从而影响了疾病的治疗，所以控制P-糖蛋白表达的Abcb1基因与多种药物有效性和安全性相关。因此构建Abcb1基因人源化大鼠模型能很好地用于新开发药物的剂量选择和药效评价。

发明内容

本发明的目的是提供一种Abcb1基因人源化大鼠模型的构建方法。

本发明的关键在于分别利用CRISPR/Cas9基因敲除技术制备大鼠基因敲除、利用BAC大片断转基因技术构建转基因大鼠模型。

该人源化大鼠的制备方法包括下列步骤：

一：含人类Abcb1基因的最长剪接体cDNA及其上下游的调控序列克隆到细菌人工染色体BAC的构建；

二：显微注射大鼠雄原核，得到阳性含人类Abcb1转基因大鼠，其包含人类Abcb1基因的最长剪接体cDNA及其上下游的调控序列，命名为hAbcb1-BAC阳性大鼠；

三：用于制作Abcb1基因敲除大鼠的sgRNA质粒构建；

四：将sgRNA和Cas9 mRNA混合注射SD大鼠雄原核，得到阳性Abcb1基因基因敲除大鼠，命名为rAbcb1基因敲除大鼠；

五：将rAbcb1基因敲除大鼠雌雄互交获得rAbcb1基因敲除纯合子大鼠；